Summary
Mostramos aqui a
Abstract
A investigação pré-clínica em modelos animais de doença arterial periférica desempenha um papel vital em testar a eficácia de agentes terapêuticos destinados a estimular a microcirculação. A escolha do método de entrega destes agentes é importante, porque a via de administração afecta profundamente a bioactividade e a eficácia destes agentes de 1,2. Neste artigo, vamos demonstrar como administrar localmente uma substância hindlimbs isquêmicos usando uma bomba osmótica cateterização. Esta bomba pode fornecer um volume fixo de solução aquosa continuamente durante um período de tempo atribuído. Nós também apresentamos o nosso modelo do rato de isquemia dos membros posteriores unilateral induzida por ligadura da artéria femoral comum proximal à origem da femoral profunda e epigastrica artérias do membro posterior esquerdo. Por fim, descreve-se a punção em vivo e ligadura da aorta abdominal infra-renal e perfusão da vasculatura hindlimb com Microfil, um agente de elenco radiopaque silicone. Microfil pode perfundir e encher todo o leito vascular (arterial e venosa), e porque já ligado a principal conduta vascular para a saída, o agente pode ser retida na vasculatura para futura imagiologia ex vivo com a utilização de pequenas amostras de micro-CT 3 .
Introduction
A doença arterial periférica (DAP) é uma doença que provoca aterosclerótica fornecimento insuficiente de sangue nas pernas 4. Ela afeta 8-12.000.000 americanos e tratamentos médicos atuais oferecem apenas um alívio limitado 5,6. Novos agentes terapêuticos que melhoram a circulação do sangue nas pernas não só restringir a progressão da doença, mas também melhorar a qualidade de vida. A incidência de PAD é maior em pessoas com idade superior a 50 anos, a terapia farmacológica para local é uma modalidade de tratamento mais desejável, porque a redução da função renal e hepática frequentemente observada em pacientes mais velhos podem diminuir o metabolismo de drogas e aumentar os efeitos colaterais com a administração sistêmica.
Assim, criamos um modelo de mouse PAD para examinar se os agentes administrados localmente aliviar a isquemia dos membros posteriores, promovendo a angiogênese ea remodelação microvascular. Especificamente, utilizou-se uma bomba osmótica cateterizada para fornecer continuamente o agente terapêutico para oisquêmico músculo da coxa de ratos. Usando o nosso sistema de entrega, fomos capazes de manter as concentrações ideais da droga no ambiente local; esta abordagem permite a bioatividade de drogas adequado, evita possíveis efeitos colaterais sistêmicos, e supera a desvantagem de acesso local da droga limitado associados com a administração sistêmica. Adicionalmente, para avaliar se os agentes localmente administrados promover revascularização, usamos fundição avançada e técnicas de imagem de alta definição que permitem a quantificação de alterações na microcirculação. Colectivamente, a combinação das metodologias utilizadas neste artigo de vídeo é útil em estudos pré-clínicos para auxiliar na compreensão revascularização farmacologicamente induzida em pacientes com DAP 7-9.
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Protocol
1. Priming da bomba osmótica
- Use técnicas estéreis (por exemplo, luvas, câmara de fluxo laminar) na preparação das bombas. Remover a bomba e regulador de fluxo a partir da embalagem. Pesar a bomba de vazio e anotar o peso (mg).
- Encher a bomba, lentamente, para evitar a criação de bolhas de ar, utilizando-se uma pequena seringa de 1 cc 27G e o tubo de enchimento de ponta romba. Quando a solução atinge a parte superior da bomba, parar o enchimento.
- Limpar o excesso de solução e peso da bomba cheia. Para a maioria das soluções aquosas, o peso em mg é o mesmo que o volume em ul. A diferença no peso vazio contra cheia deve ser mais do que 90% do volume de enchimento significativo especificado. Se não, evacuar a bomba de seringa e com a recarga. Se tiver dificuldade técnica, por favor consulte a seção de solução de problemas das instruções de bomba em http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html
- Use uma pinça para quebrar o branco flange do moderat fluxoou, tenha cuidado para não dobrar ou esmagar o tubo. Anexar um cateter P50 para cada extremidade do moderador, cobrindo cerca de 3-4 mm. Usando uma seringa para encher o cateter e anexado moderador e deixar a seringa fixada à parte distai do cateter.
- Inserir o regulador de fluxo para dentro da bomba até que o cateter esteja nivelada com a superfície da bomba. Em seguida, remover a seringa a partir da extremidade distal do cateter. Coloque a bomba numa solução salina estéril a 0,9% ou em solução de PBS a 37 ° C incubadora durante um mínimo de 6 horas (de preferência S / N) para accionar a bomba, antes da implantação em que o rato. A taxa de entrega da bomba varia com o número do modelo (por exemplo, Modelo 1002 = 0,25 ul / h durante 14 dias).
2. Criação de isquemia dos membros posteriores Unilateral no Rato
- Anestesiar ratos com o conjunto entre 2-4% de isoflurano em 100% de O 2 a uma taxa de fluxo de 0,4 L / min e remover o cabelo (de preferência um dia antes da cirurgia) sobre a área do membro posterior e para trás com um depilatocreme ry.
- Esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos antes da cirurgia. Posicione o mouse na câmara de indução anestésica. Use as mesmas configurações de anestesia descritos na Seção 2.1.
- Espere até que o mouse não é sensível a estímulos externos e, em seguida, colocá-lo na posição de bruços em cima da mesa de operação com um cone de nariz equipada que fornece um fluxo contínuo de isoflurano (1,5-2,0%).
- Injectar a dose recomendada de anestésico (bupivacaína, 0,25% (<1 mL / kg)) no local da incisão, tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol. Adicione uma incisão de 4-6 mm na parte de trás (para o lado da coluna vertebral, na região escapular). Separe a membrana subcutâneo com uma pinça fina, em seguida, vire o mouse para a posição supina tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol e fazer 0,8-1 cm incisão com tesoura micro-cirúrgicos acima do joelho em direção à coxa medial, seguindo o caminho da artéria femoral.
- Tunnel até olado do torso com a pequena tubagem de revestimento (6-French) a partir da coxa medial a incisão nas costas.
- Posicione o mouse na posição prona. Remover a bomba osmótica ferrado / cateter a partir da solução de PBS e guiar o cateter, através do tubo de revestimento, para a coxa.
- Colocar a bomba dentro da parte traseira e fechar a incisão traseira com sutura prolene 6-0 (tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol). Coloque a parte traseira do rato na posição supina; remover o tubo de revestimento, deixando o cateter exposto através da incisão na coxa. Fixe a perna com fita cirúrgica.
- Separou-se a gordura do tecido subcutâneo para revelar a vasculatura. Para melhor visualizar a vasculatura, use um afastador para abrir a incisão.
- Pierce a bainha femoral membranoso delicadamente usando uma pinça fina pontas para acessar o feixe vascular. Dissecar e separar a artéria femoral da veia femoral e nervo perto da virilha, tomando cuidado para não causar exsangramento sivo.
- Colocar duas suturas adjacentes prolene 8-0 para interromper a artéria femoral de 2-3 mm proximal à bifurcação femoral (a origem da femoral profunda e epigastrica artérias).
- Corte o cateter para o comprimento adequado e coloque a ponta para a região ântero-lateral da coxa, prendendo-o com um 6-0 prolene sutura da fáscia superficial para garantir a entrega alvo da substância. Fechar a incisão perna com um 6-0 sutura. Administrar um final de injecção subcutânea de analgésico (buprenorfina, 0,1 mg / kg), tratar a pele com uma solução de iodo-povidona seguido por 70% de etanol e devolver o rato para o compartimento. Use uma lâmpada de aquecimento durante a recuperação.
- Depois de um período de recuperação de 30 minutos, prepare o mouse para Doppler laser para confirmar a criação da isquemia dos membros posteriores.
- Monitorizar os animais duas vezes por dia, durante 5 dias após a cirurgia. A mobilidade do animal será observada a ocorrência de dor, os resíduos na gaiola servirá como uma indiator de comer. Além disso, durante o período de monitor de determinar se o animal está sentindo dor ou desconforto e dar uma injeção subcutânea de buprenorfina (0,1 mg) duas vezes ao dia.
3. Imagem Preparação de Amostras
- Anestesiar o mouse como indicado na Seção 2.1. Transferir o mouse em cima da mesa de operação na posição supina. Injectar 1000 UI de heparina por via subcutânea para prevenir a coagulação na vasculatura. Enquanto o rato é ligado ao cone de protecção, efectuar uma incisão grande o suficiente para expor a cavidade torácica e o abdómen inferior. Mover os órgãos abdominais para o lado esquerdo do animal, para expor a aorta abdominal infra-renal (IAA). Separar cuidadosamente a aorta a partir da veia cava inferior.
- Ligar o IAA proximal para reduzir o sangramento durante a inserção do cateter. Então, faça uma pequena incisão no IAA. Insira um 27 ½ G brusco da agulha (ligada a um cateter P10) no IAA e prenda-o com um 6-0.
- Encha dois20cc seringas com solução salina heparinizada e 10% de formalina neutra tamponada (NBF). Encha uma seringa 5cc com um composto de borracha de silicone radiopaco contraste. Misture os três ingredientes do MV-composto: MV-diluente: MV agente de cura em relações de trabalho dos 1:1.25:0.5. Uma vez que a mistura (Microfil) tem apenas um tempo de trabalho de 20 minutos antes do agente de polimeriza, não é recomendado para adicionar o agente de cura até MV direita antes da injecção na vasculatura.
- Fazer um corte no átrio direito e administrar uma dose excessiva de isoflurano para induzir a eutanásia e para permitir a drenagem do excesso de fluido. Fixe a seringa cheia de soro fisiológico para a ponta da agulha e começar a limpar a vasculatura por 5 min. Certifique-se de todo o sangue é liberado para fora dos vasos, desligue o isoflurano e desconecte o nosecone uma vez que a descarga começa. Em seguida, juntar a seringa cheia de formalina, o cateter descrito acima (3.2) e da pressão para perfundir um adicional de 5 min. Finalmente, o último perfundir seringa, com o contrasteagente, lentamente no ratinho durante 5 min.
- Opcional: Fotografia do Microfil na vasculatura com uma câmara para garantir que apenas a estrutura arterial é perfundido.
- Posicione o mouse em um recipiente com 10% de NBF e armazenar a 4 ° CO / N para a polimerização do agente de contraste. Após 24 horas, remover a pele na parte inferior do tronco (distai para a ligação da aorta abdominal inferior), utilizando ferramentas de dissecação, atualizar a NBF a 10%, e coloca o rato volta para o recipiente durante mais 4 dias à TA.
- Dissecar os membros posteriores contralateral e isquêmico, e colocar as amostras em uma solução de ácido fórmico (Cal-Ex II) por 48 horas para facilitar a descalcificação do osso. Em seguida, lave as peças em água corrente por 1 hora e voltar para 10% NBF e prosseguir com Faxitron (sistema de raio-x usado para garantir o osso é descalcificado) e micro-tomografia computadorizada.
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Representative Results
A animação demonstra a inserção de bomba osmótica e cirurgia da isquemia dos membros posteriores detalhados no protocolo. Figura 1 mostra imagens laser Doppler de perfusão do membro posterior, o que confirma a isquemia. Após o vazamento vascular com Microfil, uma imagem da rede microvascular-CT 3D mostra que Microfil pode preencher efectivamente os vasos (Figura 2A), mas que as descontinuidades podem ocorrer (Figura 2B), devido a vários factores processuais (por exemplo, bolhas de ar, a falta de pressão, viscosidade da Microfil).
Animação Legenda
- Colocar o rato na posição de bruços e fazer uma incisão sobre a sua parte traseira na parte lateral da coluna vertebral.
- Expor a pequena incisão de volta.
- Posicione o mouse na posição supina e fazer uma pequena incisão acima do joelho na coxa medial.
- Separa-se a pele, expor a vasculatura, e inserir o tubo de bainha-se o tronco lado do compue de volta para a incisão.
- Aqui a bomba osmótica e inserir o cateter na tubagem bainha.
- Posicione o mouse na posição supina e orientar o cateter através da tubulação para a incisão na coxa.
- Posicione o mouse na posição prona e colocar a bomba em suas costas e fechar a incisão.
- Posicione o mouse na posição supina e remover o tubo de revestimento.
- Puxar a pele com um retractor e utilizar ferramentas de microcirurgia para separar a veia a partir da artéria. Duas vezes ligar a artéria femoral acima da bifurcação femoral com sutura.
- Fixar o cateter para o tecido superficial da coxa.
- Fechar a incisão perna com sutura.
Figura 1. Confirmação de isquemia hindlimb via a laser Doppler perfusão imager. Doppler O representante imagens show a perfusão de sangue antes e após a ligadura cirúrgica da artéria femoral no membro posterior do rato. A isquemia foi criado no membro posterior esquerdo (ver setas).
Figura 2. Imagem de vasculatura dos membros posteriores Micro-CT 3D. Vazamento vascular com Microfil revelam uma rede de veias e artérias, ao longo do membro posterior (A). Descontinuidade da Microfil também pode ocorrer (B), impossibilitando a visualização de uma rede vascular detalhada (ver setas).
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Discussion
Aqui apresentamos um método para a droga / substância entrega osmótica em um modelo do rato de isquemia dos membros posteriores. Além disso, descrevemos uma técnica de fundição em que temos usado Microfil para produzir uma reconstrução 3D para análise da rede vascular.
O grau ou a gravidade da isquemia varia de acordo com a qual a ligadura / excisão arterial é feita. Criamos uma ligação dupla na artéria femoral comum proximal à origem da femoral profunda e epigastrica artérias, esta abordagem pode produzir uma isquemia mais grave no membro posterior distal. Certifique-se de monitorar os animais após a cirurgia e proporcionar alívio da dor pela administração local de analgésicos. Além disso, a Microfil nem sempre pode perfundir vasculatura membro completamente. Assim, é importante assegurar que todo o sangue é lavado da vasculatura, após a perfusão da solução salina heparinizada. Razões para a perfusão incompleta da Microfil incluem a falta de umpressão pplied ou viscosidade imprópria da Microfil, ambos os quais devem ser adequados para assegurar a Microfil atinge as regiões mais distais do membro posterior e, assim, preenche toda a vasculatura. Para resolver esses problemas, aplique pressão consistente a 100 mmHg e experiência com o composto: os índices de diluente para a aplicação animal particular.
Para estudar arteriogênese (crescimento artéria colateral pré-existente), a abordagem ideal é ligar a artéria femoral imediatamente distal à origem do ramo femoral profunda para redirecionar o fluxo de sangue para os vasos colaterais. No entanto, a resposta a este procedimento varia amplamente entre as estirpes de ratinho, e a extensão da isquemia pode ser insuficiente em algumas estirpes de ratinho (por exemplo, ratinhos C57BL / 6). Um modelo isquémico menos grave pode não proporcionar uma janela de tempo prolongado, para investigar os efeitos terapêuticos em estirpes fortemente vascularizados, tais como rato C57BL / 6. Para evitar esses problemas, criamos hindlimb isquemia by ligadura da artéria femoral proximal, que criou uma isquemia mais grave para melhor demonstrar os efeitos locais de liberação de drogas, no entanto, essa abordagem impede uma análise de arteriogênese nas profundas vasos colaterais ramos proximais. Assim, os efeitos terapêuticos são desenhados principalmente da região isquémica distal, o que é consistente com a localização anatómica (coxa anterolateral) em que o medicamento / substância é libertada. Durante a cirurgia, é fundamental para não ferir a veia femoral frágil, porque o sangramento local pode levar à inflamação e edema, que afetam tanto arteriogênese e angiogênese. Recomendamos o uso de 8-0 prolene para ligar a artéria femoral com um laço nó adequado para evitar a extensão, tensão, ou ruptura da artéria. Além disso, a Microfil deve ser utilizado imediatamente (dentro de 20 min) após a mistura dos ingredientes (composto 3, diluente e agente de cura), porque ele polimeriza rapidamente, o que cria dificuldades técnicas para a injecção. Como anteriormente staTed, Microfil, nem sempre com sucesso perfundir a vasculatura menor, mas a prática eo uso de técnicas adequadas pode ajudar a superar essa limitação.
O volume de enchimento da bomba deve ser superior a 90% do volume de enchimento significativo, se não, o ar adicional poderá ficar preso no interior da bomba. Informações técnicas adicionais está localizado na www.alzet.com . Além disso, o agente deve ser pelo Microfil a viscosidade preferida para uma aplicação particular, assim que a relação de diluente para o composto pode precisar de ser modificados.
O modelo de isquemia dos membros posteriores é altamente reprodutível e é aplicável a DAP 10,11. A entrega de agentes terapêuticos estáveis neste modelo é necessário obter resultados informativos 2. Em conclusão, a técnica de imagem 3D que usamos para visualizar as estruturas morfológicas é uma excelente ferramenta para a análise da vascularização do mouse e fornece um sistema poderoso para studyipatologias vasculares GN.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesse. Todos os procedimentos com animais foram conduzidos de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC) da Universidade do Texas Health Science Center em Houston.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer Keith Michel do MD Anderson pequena instalação de imagem animal para a sua assistência técnica com micro-tomografia computadorizada, Edward TH Yeh, MD, para a assistência cirúrgica e Rebecca Bartow, PhD, para a assistência editorial. Este trabalho foi financiado em parte pela American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
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