ハイスループットマイクロプレートアッセイを用いてウォーターズ、土壌、および底質中の微生物細胞外酵素活性の測定
Summary
マイクロプレートベースの手順は、細胞外酵素活性の比色または蛍光分析に記載されている。これらの手順は、管理可能な時間枠内で環境サンプルの大規模な数のこのような活動の迅速なアッセイを可能にします。
Abstract
自然環境での栄養循環と炭素処理の多くは、微生物が発表した細胞外酵素の活性を介して行われます。従って、これらの細胞外酵素の活性の測定は、このような有機物分解または窒素およびリンの石灰化などのエコシステムレベルプロセスの速度への洞察を与えることができる。環境試料中の細胞外酵素活性のアッセイは、典型的には人工的な比色または蛍光基質にサンプルを曝露し、基質加水分解の速度を追跡することを含む。ここでは、短い時間枠内で多数のサンプルの分析を可能にするこれらの手順のために、マイクロプレートベースの方法を記載している。サンプルを、ディープウェルマイクロプレート·ブロック96ウェルマイクロプレート内で人工的基質と反応させ、酵素活性は、その後、標準的なマイクロプレートReadeのを使用して得られた最終生成物の吸収または蛍光によって決定されるRまたは蛍光光度計。そのようなハイスループットの手順は、空間的に別個の部位又は生態系間の比較を容易にするだけでなく、実質的にサンプルごとに必要な全体的な試薬容量を低減することによりそのようなアッセイのコストを低減するだけでなく。
Introduction
細菌や真菌などの微生物は、細胞外酵素の産生を介して複雑な有機化合物からの栄養と炭素を得る。これらの酵素は、典型的には、細胞内に取り込まれ得るより小さなサブユニットにポリマーを加水分解する。そのため、生態系のレベルでは、これらの微生物の細胞外酵素は、栄養の石灰化や自然環境の中で発生する有機物分解の多くを担当している。このようなビオヒドロラーゼ（CBH）およびβ-グルコシダーゼなどの酵素は、微生物の取り込みや同化のための利用可能な炭素基材を提供する1,2グルコースへのセルロースの加水分解を触媒するために一斉にセルロース分解や仕事のために重要である。有機リン酸からの酵素ホスファターゼ放出性無機リン酸基、本質的にリン酸塩を鉱化し、ほとんどの生物3による使用に利用可能にする。例えば、N-アセチル（ナガセ）のような他の酵素は、importanですTキチン分解における微生物の取得4用の炭素と窒素の両方を利用できるようにすることができます。
自然環境中の微生物の細胞外酵素活性のアッセイのための手順のいずれかは人工的なp-ニトロフェニル（p個の NP）の使用は、本来の土壌5ホスファターゼ活性を検出するために開発されたアプローチの基板を連結している。このアプローチは、人工基質を適切な酵素によって加水分解されるときに放出される着色最終生成物、p-ニトロフェノールの検出に依存する。 p-ニトロフェノールは、その後、周りの400〜410nmでの吸光度を測定することによって比色定量することができる。この方法は、例えば、日時のNAGase 6のような他の酵素を検出するために適用されており、土壌や堆積物7-9中の微生物細胞外酵素活性を調べる様々な研究で使用されている。
originallた別のアプローチyは10,11が 4 -メチルウンベリフェロン（MUB）連結された基材を使用する水環境における細胞外グルコシダーゼ活性を評価するために開発された。 （4 – メチルウンベリフェロン）放出最終生成物は、高度に蛍光性であり、460分の360付近の励起/発光の設定で蛍光光度計を用いて検出することができる。 MUB連動人工様々な基材は、P NP-基質比色手順を用いてアッセイすることができるように少なくとも同じ数の酵素（ 例えば 、β-グルコシダーゼ、ビオヒドロラーゼ、長瀬ホスファターゼ）の活性の蛍光測定を可能に用意されています。このようなタンパク質分解ロイシンアミノペプチダーゼのような他の微生物の細胞外酵素は、7 – アミノ-4 – メチルクマリン（COU）リンクされた基質を用いて蛍光定量的にアッセイすることができる。両方MUB-とカップリンクされた基板は、様々な陸上および水生サンプル12,13中の酵素活性を測定するために使用されている。
これまでの研究では、一行コメントがありますがアイベッド蛍光または比色マイクロプレートは、細胞外酵素活性14を決定するために近づくと、このようなアッセイを実施する方法の明確なプレゼンテーションが必要とされている。ここでは、比色Pの NP-連結基板アプローチを使用して土壌と堆積物中の蛍光MUB-連結基板技術を用いて、天然水中の細胞外酵素活性の分析のためのハイスループットマイクロプレート法を実施するための手順を示しています。我々は、β-グルコシダーゼ、のNAGaseの活性の測定に注目し、これらの酵素のようなホスファターゼは、それぞれ、炭素、窒素、およびリン循環に接続することができる。しかしながら、ここで説明する手順は、異なる人工基質を用いて他の細胞外酵素の測定に適用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
土壌や堆積物中の微生物の細胞外酵素の様々な活性を測定することは、栄養無機化と有機物処理17の速度に有益な洞察を提供することができます。しかし、土壌はそれらの水分レベルで変化させることができるので、土壌の乾燥重量に対して活性を標準化することが重要である。これは単に、酵素活性を測定することを越えて（典型的には2日間の）追加の乾燥工程を必要とする。こ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この仕事の側面のための資金は、米国農務省の特定協力協定58-6408-1-595、国立科学財団（賞1049911）など、さまざまなソースから提供された。
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
Referências
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