Определение микробной внеклеточной ферментативной активности в вод, почв и донных отложений с использованием высокой пропускной MICROPLATE Анализы
Summary
Процедуры для микропланшетов на основе описаны для колориметрического или флуорометрического анализа внеклеточной активности фермента. Эти процедуры позволяют для быстрого анализа такой деятельности в большом количестве проб окружающей среды в пределах приемлемого периода времени.
Abstract
Большая часть питательных веществ и переработки газа в природных средах происходит благодаря активности внеклеточных ферментов, опубликованным микроорганизмов. Таким образом, измерение активности этих внеклеточных ферментов может дать понимание скоростей процессов на уровне экосистем, таких как органического разложения вещества или азота и минерализации фосфора. Анализы внеклеточной ферментативной активности в пробах окружающей среды обычно включают подвергая образцы искусственных колориметрических или флуорометрическими субстратов и отслеживания скорости гидролиза субстрата. Здесь мы опишем микропланшета на основе методов для этих процедур, которые позволяют анализ большого количества образцов в течение короткого периода времени. Образцы подвергают взаимодействию с искусственных субстратах в 96-луночные микропланшеты или глубокий луночный микропланшет блоков, и активность фермента впоследствии определяется поглощения или флуоресценции полученного конечного продукта с использованием обычного микропланшетов Ридг или флуорометр. Такие процедуры высокой пропускной не только облегчит проведение сравнений между пространственно отдельных участках или экосистем, но и существенно снизить затраты на таких анализов за счет снижения общих объемов реагентов, необходимых на образец.
Introduction
Микроорганизмы, такие как бактерии и грибы получить питательные вещества и углерод из сложных органических соединений за счет производства внеклеточных ферментов. Эти ферменты обычно гидролиза полимеров на более мелкие субъединицы, которые могут быть приняты в клетку. Таким образом, в экологической уровне эти микробные внеклеточных ферментов отвечают за большую часть питательных веществ минерализации и разложения органических веществ вещества, которое происходит в естественных условиях. Ферменты, такие как целлобиогидролазы (СВН) и β-глюкозидазы важны для деградации целлюлозы и работать в унисон, чтобы катализировать гидролиз целлюлозы в глюкозу 1,2, который обеспечивает утилизируемых углерода субстрат для микробного поглощения и ассимиляции. Фермент фосфатазы релизы растворимых неорганических фосфатных групп из органофосфаты, по существу минерализации фосфата и сделать его доступным для использования большинства организмов 3. Другие ферменты, такие как N-ацетилглюкозаминидазы (Nagase), являются importanт к деградации хитина и может сделать как углерод и азот, доступной для микробов приобретения 4.
Одна из процедур анализа микробной внеклеточной ферментативной активности в естественных условиях является использование искусственного п-нитрофенила (р NP), связанные субстратов, подход, который изначально разрабатывался для обнаружения почвы активность фосфатазы 5. Этот подход основан на обнаружении цветной конечного продукта, п-нитрофенола, который выделяется, когда искусственный субстрат гидролизуют с помощью соответствующего фермента. П-нитрофенол может быть впоследствии количественно колориметрическим путем измерения его абсорбцию в пределах 400-410 нм. Этот метод стал применяться для обнаружения других ферментов, таких как Нагасе 6, и был использован в различных исследований, глядя на микробной внеклеточной ферментативной активности в грунтов и отложений 7-9.
Альтернативный подход, который был Originallу разработаны для оценки внеклеточный глюкозидазы в водной среде 10,11 использует 4-метилумбеллиферона (MUB), ссылки на подложках. Конечный продукт выпущен (4-метилумбеллиферона) весьма люминесцентные и могут быть обнаружены с помощью флуорометр с установкой возбуждения / эмиссии вокруг 360/460 нм. Разнообразные MUB-связанных искусственных субстратах доступны, позволяя флуорометрического измерение активности по крайней мере, многих ферментов (например, β-глюкозидазы, целлобиогидролазы, Нагасе, фосфатазы), а могут быть проанализированы с помощью р NP-подложка колориметрического процедуру. Другие микробные внеклеточные ферменты, такие как протеолитических лейцинаминопептидазы, может быть проанализирована с помощью флуорометрически 7-амино-4-метилкумарин (COU), связанных субстратов. Оба MUB-и COU-связанные субстраты были использованы для определения активности фермента в различных наземных и водных образцов 12,13.
В то время как предыдущие исследования имеют DescrIBED флуорометрический или колориметрический микропланшет подходы для определения внеклеточный активность фермента 14; существует необходимость четкого представления о том, как проводить такие анализы. Здесь показано, процедуры проведения высокие методы пропускная способность микропланшета для анализа внеклеточной ферментативной активности в грунтов и отложений с использованием колориметрического р NP-сшитый субстратов подход и в природных водах с использованием флуоресцентного MUB-связанный субстратов техники. Мы делаем ставку на измерении деятельности β-глюкозидазы, Nagase и фосфатазы как эти ферменты могут быть привязаны к углерода, азота, фосфора и велосипедного соответственно. Однако процедуры, описанные здесь, могут быть применены к измерению других внеклеточных ферментов, использующих различные искусственные субстраты.
Protocol
Representative Results
Discussion
Определение активности различных микробных внеклеточных ферментов в почвах и донных отложениях может предоставить полезную информацию в темпах питательной минерализации и переработки органического вещества 17. Однако почвы может изменяться в их уровней влажности, поэтому важ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансирование аспектов этой работы была предоставлена различных источников, включая США Департамент сельского хозяйства Удельный соглашение о сотрудничестве 58-6408-1-595 и Национального научного фонда (премии 1049911).
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
Referências
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -. E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -. G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
