Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi
Summary
Mikroplaka dayalı işlemler hücre dışı enzim aktivitesi, kolorimetrik veya florometrik analizi için tarif edilmiştir. Bu işlemler yönetilebilir bir süre içinde çevre örneklerin çok sayıda bu tür aktivitenin hızlı analizi için izin verir.
Abstract
Doğal ortamlarında besin döngüsü ve karbon işleme çok mikroorganizmaların serbest hücre dışı enzimlerin aktivitesi ile gerçekleşir. Bu nedenle, bu hücre dışı enzimlerin aktivitesinin ölçülmesi gibi organik madde ayrışma ya da azot ve fosfor gibi mineralizasyon ekosistem seviyesi süreçlerin oranları içine bakış açısı verebilir. Çevresel numunelerde hücre dışı enzim aktivitesi deneyleri, genellikle, yapay kolorimetrik veya florometrik substratlara örnekleri maruz bırakılması ve substrat hidroliz hızı izleme içerir. Burada kısa bir süre içinde örnekleri çok sayıda analizine izin bu işlemler için mikrolevha tabanlı yöntemleri açıklanmaktadır. Örnekler mikro blok mikro ya da derin kuyu 96 oyuklu içinde yapay alt-tabakalar ile reaksiyona girmesine izin verilir ve enzim aktivitesi, daha sonra, tipik bir mikro-Reade kullanılarak elde edilen son ürünün emilim veya floresan ile belirlenirr veya florimetre. Bu gibi yüksek üretim işlemleri uzaysal olarak ayrı bölgelerde veya ekosistemlerin arasında karşılaştırma sağlamak değil, aynı zamanda esasen genel olarak, numune başına gerekli reaktif hacimlerini azaltarak Bu tahlillerin maliyetini azaltmak değil.
Introduction
Bakteri ve mantar gibi mikroorganizmaların hücre dışı enzimlerin üretimi ile kompleks organik bileşiklerin besin ve karbon elde edilir. Bu enzimler, tipik olarak hücre içine alınabilir daha küçük alt-birimler halinde polimerler hidrolize. Bu nedenle, ekolojik bir seviyede, bu mikrobiyal hücre dışı enzimler besin mineralizasyonu ve doğal ortamlarında olarak ortaya çıkan organik madde ayrışımı daha sorumludur. Bu tür sellobiyohidrolaz (CBH) ve β-glukosidaz gibi enzimler mikrobiyal alımı ve asimilasyonu için kullanılabilen bir karbon taban malzeme oluşturur 1,2 Selülozun glukoza hidroliz, katalize etmek için uyum içinde selüloz bozulması ve çalışmaları için önemlidir. Enzim fosfataz organofosfatlar çözünür inorganik fosfat gruplarını, esas olarak fosfat mineralleştirici ve en çok 3 organizmalar ile kullanım için uygun hale serbest bırakır. Örneğin N-acetylglucosaminidase (Nagase) gibi diğer enzimler, importan vardırkitin bozulması t karbon ve mikrobiyal edinimi 4 için kullanılabilir hem de azot yapabilirsiniz.
Doğal ortamlarında mikrobiyal hücre dışı enzim etkinliğinin test edilmesi için prosedürlerin bir yapay p-nitrofenil (p NP) bağlanmış alt-tabakalar, orjinal toprak fosfataz aktivitesi 5 tespit etmek için geliştirilmiş bir yaklaşım kullanılmasıdır. Bu yaklaşım yapay alt-tabaka, uygun bir enzim ile hidrolize edildiğinde serbest renkli bir son ürün, p-nitrofenol, tespit dayanır. P-nitrofenol, daha sonra yaklaşık 400-410 nm'de absorbans ölçümü ile kolorimetrik tayin edilebilir. Bu yöntem, bu yana böyle Nagase 6 gibi diğer enzimleri tespit etmek için uygulanmıştır ve toprak ve sediment 7-9 mikrobik hücre dışı enzim aktivitesi şu an çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır.
Orjinal oldu alternatif bir yaklaşımy 10,11 4-metilumbelliferon (MUB) bağlanmış alt-tabakaların kullanan su ortamlarında hücre dışı glukosidaz aktivitesini değerlendirmek için geliştirilmiştir. (4-metilumbelliferon) serbest son ürün yüksek floresan ve 360/460 nm civarında bir uyarım / emisyon ayarına sahip bir flüorometre kullanılarak tespit edilebilir. MUB bağlanmış yapay alt-tabakalar arasında çeşitli p NP-kolorimetrik alt-tabaka prosedürü kullanılarak analiz edilebilir olarak en az bir çok enzim (örneğin, β-glukosidaz, selobiyohidrolaz, Nagase, fosfataz) aktivitesinin fluorometrik ölçümü olanak mevcuttur. Örneğin protein-bozucu lösin aminopeptidaz gibi diğer mikrobik hücre dışı enzimler, 7-amino-4-metilkumarin (COU) bağlanmış alt-tabakalar kullanılarak florometrik olarak analiz edilebilir. MUB-ve çiftler bağlanmış alt tabakalar hem de çeşitli karasal ve su örnekler 12,13 enzim aktivitesini belirlemek için kullanılmıştır.
Önceki çalışmalar descri varkenIBED florometrik ya da kolorimetrik mikro hücre dışı enzim aktivitesi 14 belirlemek için yaklaşımlar, bu tür testleri yapmak için nasıl açık bir bakış açısı için bir ihtiyaç vardır. Burada kolorimetrik p NP-bağlanmış alt-tabakalar yaklaşım kullanılarak topraklar ve sediment ve floresan MUB-bağlanmış alt-tabakalar tekniği kullanılarak, doğal sularda, hücre dışı enzim aktivitesinin analizi için yüksek verimli mikro teknikleri yapılması için işlemleri göstermektedir. Bu enzimler, sırasıyla, karbon, azot, fosfor ve bisiklet bağlı olabilir olarak biz β-glukosidaz, Nagase ve fosfataz etkinliklerinin ölçümü odaklanır. Bununla birlikte, burada açıklanan usuller farklı yapay substratlar kullanılarak diğer hücre dışı enzimler ölçümüne uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Toprak ve tortular mikrobiyal hücre dışı enzimlerin çeşitli aktivitesini belirlemede besin mineralizasyon ve organik madde işleme 17 oranlarında yararlı açılımlar sağlayabilir. Ancak, toprak kendi nem düzeyleri değişebilir, bu nedenle toprak kuru ağırlık aktivitesi standart önemlidir. Bu sadece enzim aktivitesinin ölçülmesi dışında (tipik haliyle iki gün) ek bir kuruma adımı gerektirir. Bu nedenle, ani sonuçlar yakın sağlamak su örneklerdeki enzim aktivitesi deneyleri aksine, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu işin yönleri için finansman Tarım Amerika Birleşik Devletleri Bölümü Özel Kooperatif Anlaşması 58-6408-1-595 ve Ulusal Bilim Vakfı (ödül 1.049.911) dahil olmak üzere çeşitli kaynaklar tarafından sağlandı.
Materials
| REAGENTS AND MATERIALS | |||
| Glacial acetic acid | Various suppliers | ||
| Sodium acetate | Various suppliers | ||
| Sodium hydroxide | Various suppliers | ||
| p-Nitrophenol | Fisher | BP612-1 | Alternates available |
| p-Nitrophenyl (pNP)-phosphate | Sigma | N3234 | pNP-substrate |
| pNP-β-glucopyranoside | Sigma | N7006 | pNP-substrate |
| pNP-β-N-acetylglucosaminide | Sigma | N9376 | pNP-substrate |
| Clear 96-well microplates | Fisher | 12-563-301 | Alternates available |
| 96-well deep well blocks | Costar | 3958 | Alternates available |
| Aluminum weigh pans | Various suppliers | ||
| Sterile 15 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| Sterile 50 ml centrifuge tubes | Various suppliers | ||
| 4-Methylumbelliferone | Sigma | M1381 | |
| 4-Methylumbelliferyl (MUB)-phosphate | Sigma | M8883 | MUB-substrate |
| 4-MUB-glucopyranoside | Sigma | M3633 | MUB-substrate |
| 4-MUB-N-acetylglucosaminide | Sigma | M2133 | MUB-substrate |
| Sodium bicarbonate | Various suppliers | ||
| Black 96-well microplate | Costar | 3792 | |
| Pipette reservoir | Various suppliers | ||
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge rotor | Eppendorf | A-4-81 | For microplates/deep-well blocks |
| Microplate reader | BioTek | Synergy HT | Alternates available |
| Microplate fluorometer | BioTek | FLx 800 | Alternates available |
| 8-channel pipettor | Various suppliers |
Referências
- Ljungdahl, L. G., Eriksson, K. -. E. Ecology of microbial cellulose degradation. Advances in microbial ecology. 8, 237-299 (1985).
- Sinsabaugh, R. L., Antibus, R. K., Linkins, A. E., Mclaugherty, C. A., Rayburn, L., Repert, D., Weiland, T. Wood decomposition over a first-order watershed: mass loss as a function of lignocellulase activity. Soil biology and biochemistry. 24, 743-749 (1992).
- Dalal, R. C. Soil organic phosphorus. Advances in agronomy. 29, 83-113 (1977).
- Sinsabaugh, R. L., Moorhead, D. L. Resource allocation to extracellular enzyme production: a model for nitrogen and phosphorus control of litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 26, 1305-1311 (1995).
- Tabatabai, M. A., Bremner, J. M. Use of p-nitrophenyl phosphate for assay of soil phosphatase activity. Soil biology and biochemistry. 1, 301-307 (1969).
- Parham, J. A., Deng, S. P. Detection, quantification and characterization of β-glucosaminidase activity in soil. Soil biology and biochemistry. 32, 1183-1190 (2000).
- Kuperman, R. G., Carreiro, M. M. Soil heavy metal concentrations, microbial biomass and enzyme activities in a contaminated grassland ecosystem. Soil biology and biochemistry. 29, 179-190 (1997).
- Olander, L. P., Vitousek, P. M. Regulation of soil phosphatase and chitinase activity by N and P availability. Biogeochemistry. 49, 175-190 (2000).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Effects of salinity and nutrient enrichment on microbial assemblages in Louisiana wetland sediments. Wetlands. 29, 277-287 (2009).
- Hoppe, H. -. G. Significance of exoenzymatic activities in the ecology of brackish water: measurements by means of methylumbelliferyl-substrates. Marine ecology progress series. 11, 299-308 (1983).
- Somville, M. Measurement and study of substrate specificity of exoglucosidase activity in eutrophic water. Applied and environmental microbiology. 48, 1181-1185 (1984).
- Freeman, C., Liska, G., Ostle, N. J., Jones, S. E., Lock, M. A. The use of fluorogenic substrates for measuring enzyme activity in peatlands. Plant and soil. 175, 147-152 (1995).
- Sinsabaugh, R. L., Findlay, S., Franchini, P., Fischer, D. Enzymatic analysis of riverine bacterioplankton production. Limnology and oceanography. 42, 29-38 (1997).
- Marx, M. -. C., Wood, M., Jarvis, S. C. A microplate fluorometric assay for the study of enzyme diversity in soils. Soil biology and biochemistry. 33, 1633-1640 (2001).
- Jackson, C. R., Weeks, A. Q. Influence of particle size on bacterial community structure in aquatic sediments as revealed by 16S rRNA gene sequence analysis. Applied and environmental microbiology. 74, 5237-5240 (2008).
- Canion, A. K., Ochs, C. The population dynamics of freshwater armored dinoflagellates in a small lake in Mississippi. Journal of freshwater ecology. 20, 617-626 (2005).
- Sinsabaugh, R. L., Lauber, C. L., et al. Stoichiometry of soil enzyme activity at global scale. Ecology letters. 11, 1252-1264 (2008).
- Jackson, C. R., Foreman, C. M., Sinsabaugh, R. L. Microbial enzyme activities as indicators of organic matter processing rates in a Lake Erie coastal wetland. Freshwater biology. 34, 329-342 (1995).
- Jackson, C. R., Vallaire, S. C. Microbial activity and decomposition of fine particulate organic matter in a Louisiana cypress swamp. Journal of the north american benthological society. 26, 743-753 (2007).
- Jackson, C. R., Liew, K. C., Yule, C. M. Structural and functional changes with depth in microbial communities in a tropical Malaysian peat swamp forest. Microbial ecology. 57, 402-412 (2009).
- Rietl, A. J., Jackson, C. R. Effects of the ecological restoration practices of prescribed burning and mechanical thinning on soil microbial enzyme activities and leaf litter decomposition. Soil biology and biochemistry. 50, 47-57 (2012).
- Smart, K. A., Jackson, C. R. Fine scale patterns in microbial extracellular enzyme activity during leaf litter decomposition in a stream and its floodplain. Microbial ecology. 58, 591-598 (2009).
