整装免疫荧光染色新生小鼠视网膜血管生成调查<em>在体内</em

Summary

新生小鼠视网膜提供了一个很好的特点生理血管生成模型，它允许不同的基因或药物，在调节血管生成的角色的调查<em>在体内</em>上下文。免疫荧光染色准确地显示血管丛是这些类型的研究成功的关键。

Abstract

血管生成是定义新的血管形成新血管从预先存在的血管网发芽的复杂过程。血管生成中起着关键作用不仅在器官和组织的正常发育，而且在许多疾病中，血管的形成是失调，如癌症，失明和局部缺血性疾病。在成年生活中，血管通常是静态的，因此血管生成是尝试和调节新血管的形成，特别是在疾病新型药物开发的重要目标。为了更好地了解血管新生，并制定相应的战略来调节，模型，准确地反映了不同的生物所涉及的步骤。小鼠视网膜新生血管生成提供了一个很好的模型，因为动脉，静脉和毛细血管的发展在出生后的第一周，形成血管丛。该模型还具有的优点是具有双 – 二mensional（2D）结构简单的决策分析较复杂的三维解剖其他血管网络。通过分析视网膜血管丛出生后在不同的时间，它是在显微镜下可以观察到的血管生成的各个阶段。本文演示了一个简单的流程分析荧光染色法，凝集素和血管特异性抗体的小鼠视网膜血管。

Introduction

血管生成是一种复杂的发育过程中，定义通过从预先存在的血管网形成新的血管，并通过多条信号通路的调节。其中最突出的是VEGF通路。血管内皮生长因子释放由缺血性细胞，导致血管生成的启动，在相邻的血管发芽。领先的内皮细胞从一个新的血管芽是'冰山'细胞，产生对VEGF的来源，伸出伪足，其次是'茎'内皮细胞增殖。在这种方式中，活化的内皮细胞迁移和增殖实现的无血管区域，在那里形成新血管管。为了稳定，以支持这些管子的血流量，血管内皮细胞与周皮细胞和平滑肌细胞，围绕新的血管^1。胚胎的血管形成及组织生长的血管生成是必不可少的。然而，它也有助于许多pathologi卡尔疾病，如癌症，而在血管生成中的缺陷与缺血性疾病。因此，开发有效的药物治疗作为治疗疾病的一种手段，是调节血管生成的极大兴趣。例如，有效的抗血管生成因子将减少癌的生长，而促血管生成的策略可以用于治疗缺血性疾病。因此，必须更好地了解新血管的形成和开发新的治疗策略，以提高或降低血管生长调节血管生成模型。

血管新生研究的基本要素是选择一个合适的血管模型。许多体外模型的目的是为了再现血管生成的基本步骤，如血管内皮细胞的迁移，增殖和存活^2,3。 在体外试验中经常使用的一种是有支链的网络上的基底膜基质的血管内皮细胞的形成，虽然吨他的是不特定的内皮细胞，也不会通常包含周细胞或平滑肌细胞的支持。评估体外芽生式血管生成，如胚体的测定，主动脉环测定和胎 ​​儿跖骨检测小鼠器官培养允许的上下文中的额外的支持细胞，血管内皮细胞的血管生成的分析。然而，这些检测方法的主要限制包括血流量不足，并随着时间的推移回归的船只，给一个有限的窗口进行分析。因此，更准确地了解血管生成的调控， 在体内模型中是必需的，如那些在小鼠皮下植入的海绵或基底膜插头开发，以及后肢缺血模型。然而，这些模型是具有挑战性的分析，由于复杂的三维结构的新生血管。与此相反，已证明斑马鱼胚胎的一个很好的模型可视化的血管生成在整个生物体^4。然而，进化更密切相关的人类比斑马鱼鼠标，让鼠标在许多情况下，一款首选机型。因此，出生后小鼠视网膜血管生成是一个很好的特点的血管生成研究的首选方法。它不仅提供了生理的设置，但也是一个二维的血管丛，可以很容易地可视化使用适当的荧光染料。血管网，血管内皮细胞增殖，发芽，血管周围细胞的招募和血管重塑的建筑都可以使用这种技术研究。

在新生小鼠视网膜，视网膜血管的发展发生在出生后的第一周。小鼠与人类不同的是，是天生的盲人和视网膜血管的出生后。视网膜血管产生的视网膜的中心靠近视神经在出生后的第0天（P0），血管生成和发展，形成高度组织ð血管丛到达视网膜周边约P8 ^5。在其特有的方式与毛细管丛逐渐成长从视盘向外朝向的外周，以产生一个有规律的交替模式具有介于其间的毛细血管网的动脉和静脉血管的发展。视网膜血管提供了一个理想模型来研究血管新生的血管可以很容易地确定，因为他们成长在什么本质上是一个二维平面，从而使得它比较容易检查视网膜血管台安装准备^5。已报道的方法，在数小时内体外内皮小费细胞反应进行分析隔离小鼠新生儿的视网膜^6。另外，需要更详细的调查整个视网膜血管和相关的血管标记免疫组的视网膜固定的标本在不同的发展阶段。

在这里，我们提供详细描述了一个可靠的和技术上直线前进的方法，我们使用整装染色小鼠视网膜血管丛，从最初的眼球摘除产后眼^（7）通过染色协议到最终成像显微镜下。

Protocol

所有步骤都在室温下进行，除非另有说明。 1。产后的眼睛剜除术和固定将人道扑杀鼠标小狗在其一侧，清除皮肤覆盖在眼睛上，用剪刀。 使用剪刀和镊子，enucleate眼睛。 将剪刀低于去核的眼睛，切开视神经及周围组织，并取出眼球。转移至24孔板中，含有4％多聚甲醛（PFA），在室温下在2×PBS。 允许每只眼睛定为10 – 15分钟，然后转移到寒冷的2?…

Representative Results

解剖后的视网膜应该看起来像平坦的花（ 图1）。通过使用上文所述的协议，使用凝集素B4 ALEXA488染色和支持血管平滑肌细胞，用抗α-平滑肌肌动蛋白（ 图2），可以看出，内皮细胞。低功耗的图，使用图2中的5倍的目标允许的视网膜血管组织的概述。此外，通过使用不同的以上的协议在给定的抗体相结合，内皮细胞，用抗CD31免疫染色使用抗NG2（ 图3），…

Discussion

这里介绍的方法提供了一个简单而有效的方式来获取图像新生小鼠视网膜染色整装准备，使得它容易量化和生理相关的血管生成模型。最初，老鼠的眼睛是相当困难的，由于其体积小，球形，解剖，所以一些做法和良好的清扫工具都需要可靠的结果。夹层2倍浓度的PBS中制备的眼睛是很重要的，因为这会导致少量的水从眼睛损失，并降低的轨道内的压力，这有利于夹层。良好的准备是非常重要的视…

Materials

			Material
Plastic pipettes 3 ml	Scientific Laboratory Supplies	PIP4210	Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates	Scientific Laboratory Supplies	353226
Select Petri dishes TV 90 mm	Scientific Laboratory Supplies	SLS2002
Histobond slides	VWR	631-0624
Coverslips 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Tweezers #5	World precision instruments	14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades	World precision instruments	501235	Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	500086	Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	501778	Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml	Starlab	E1420-2000
			Reagents
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876	PBS reagent
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	PBS reagent
Sodium chloride	Sigma	S9625	PBS reagent
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Donkey serum	Sigma	D9663
Goat serum	Vector	S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36930	Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Use at 1:200 dilution
			Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal )	Millipore	AB5320	Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)	Millipore	MAB360	Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)	Millipore	04-585	Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )	Chemicon	AB756P	Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)	Sigma	C6198	Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550546	Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)	BD Pharmingen	553370	Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550548	Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal)	R&D Systems	AF770	Detects endothelial cells
			Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488	Invitrogen	A11006	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594	Invitrogen	A11007	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488	Invitrogen	A11029	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594	Invitrogen	A11058	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
			Microscopes
Dissection microscope	Zeiss	Stemi SV6
Camera	Zeiss	Axiocam HRc	Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope	Zeiss	Axioimager with Apotome
Camera	Zeiss	Axiocam HRm	Camera for Axioimager
Confocal Microscope	Nikon	A1R