Всего горе иммунофлуоресцентного окрашивания новорожденных Retina мыши по расследованию ангиогенеза<em> В естественных условиях</em

Summary

Неонатальной мышиной сетчатки обеспечивает хорошо характеризуется физиологической модели ангиогенеза, который позволяет исследования роли различных генов или наркотиков, которые модулируют ангиогенеза в<em> В естественных условиях</em> Контекста. Иммунофлуоресцентного окрашивания точно визуализировать сосудистое сплетение имеет решающее значение для успеха такого рода исследований.

Abstract

Ангиогенез представляет собой сложный процесс образование новых кровеносных сосудов определяется прорастание новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети. Ангиогенез играет ключевую роль не только в нормальном развитии органов и тканей, но и во многих заболеваний, при которых образование кровеносных сосудов является нарушение регуляции, таких как рак, слепоту и ишемических заболеваний. Во взрослой жизни, кровеносные сосуды, как правило, так покоя ангиогенеза является важной мишенью для разработки лекарств романа, чтобы попытаться регулировать образование новых кровеносных частности, в болезни. Для того, чтобы лучше понять, ангиогенез и разработать соответствующие стратегии для регулирования его, требуются модели, которые точно отражают различные биологические шаги, которые участвуют. Сетчатки новорожденных мышей обеспечивает отличную модель ангиогенеза, поскольку артерии, вены и капилляры развиваются, чтобы сформировать сосудистого сплетения в течение первой недели после рождения. Эта модель также имеет то преимущество, что два-димерные (2D) структуры делает анализ простым по сравнению со сложными 3D анатомии других сосудистых сетей. Путем анализа сосудов сетчатки сплетения в различные моменты времени после рождения, можно наблюдать различные этапы ангиогенеза под микроскопом. В данной статье рассматривается простой процедуры анализа сосудистой сетчатки мыши с помощью флуоресцентного окрашивания isolectin и сосудистых специфических антител.

Introduction

Ангиогенез представляет собой сложный процесс развития определяется образование новых кровеносных сосудов из ранее существовавших сосуд сети и регулируется несколькими путями передачи сигналов. Наиболее известным из них является VEGF пути. VEGF высвобождается ишемических клеток и приводит к инициированию ангиогенеза в соседних кровеносных сосудов. Ведущим эндотелиальных клеток из нового сосудистого прорастают является клетка 'чаевые', которое производит филоподии, что протянуть руку по направлению к источнику VEGF, и сопровождается пролиферирующих эндотелиальных клеток стебля. Таким образом, активированные эндотелиальные клетки мигрируют и пролиферируют в направлении лишенной сосудов области, где они образуют новый сосудистых трубок. Для того чтобы стабилизировать эти трубы, чтобы поддерживать кровоток, эндотелиальные клетки взаимодействуют с перицитов и гладкомышечных клетках, которые окружают новых кровеносных сосудов ^1. Ангиогенез является существенным для васкуляризации эмбриона и рост тканей. Однако, это также способствует развитию многих патологическихкал заболеваний, таких как рак, тогда как дефекты в ангиогенез, связанный с ишемической болезнью. Разработка эффективных лекарств для регулирования ангиогенеза в качестве средства лечения болезни поэтому представляет большой интерес. Например, эффективные анти-ангиогенных факторов приведет к снижению роста опухоли, в то время проангиогенные стратегии могут быть использованы для лечения ишемических заболеваний. Таким образом, модели ангиогенеза необходимы, чтобы лучше понять регулирование образование новых кровеносных и для разработки новых терапевтических стратегий для повышения или уменьшения роста сосудов.

Основополагающим элементом ангиогенеза исследования является выбор подходящего сосудистой модели. Многие в пробирке модели были разработаны для воспроизведения основные этапы ангиогенеза, таких как миграция эндотелиальных клеток, пролиферацию и выживание ^2,3. Часто используемым в анализе пробирке является формирование разветвленной сети эндотелиальных клеток на матрицу Матригель, хотя тего не является специфичным для эндотелиальных клеток, а также не обычно включают поддержку перицитов и гладкомышечных клеток. Оценка исключая виво прорастание кровеносных сосудов использованием культуры мышь органов, таких как эмбриональные анализ тела, аортальный анализа кольцо и плода плюсневой анализ позволяет проводить анализ ангиогенеза эндотелиальные клетки в контексте дополнительных вспомогательных клеток. Однако основным ограничения этих анализов включают отсутствие кровотока и регрессии сосудов с течением времени, что дает ограниченное окно для анализа. Поэтому, чтобы понять регуляции ангиогенеза, точнее, в естественных условиях модели требуются например, разработанных в мыши с помощью подкожно имплантировали губки или Матригель зажигания, а также задние модели ишемии нижних конечностей. Тем не менее, эти модели являются сложными для анализа из-за сложных 3D архитектуру новых сосудов. В противоположность этому, данио эмбриона оказалось отличной моделью для визуализации ангиогенеза в целоморганизма ^4. Тем не менее, мышь эволюционно гораздо более тесно связаны с человеческим, чем данио рерио, что делает мышь предпочтительной моделью во многих случаях. Следовательно ангиогенеза послеродовой сетчатки мыши представляет собой хорошо охарактеризованы методом выбора для исследования ангиогенеза. Это не только обеспечивает физиологический установки, но и 2D-сосудистом сплетении, которые можно легко визуализируют с использованием соответствующих флуоресцентных красителей. Архитектура сети судна, пролиферацию эндотелиальных, прорастание, периваскулярные набора клеток и сосудов реконструкции могут быть исследованы с помощью этой техники.

В неонатальный сетчатки мыши, развитие кровеносных сосудов сетчатки происходит в первые недели постнатальной жизни. Мыши, в отличие от людей, рождаются слепыми и сетчатка стала васкуляризированной только после рождения. Сосудов сетчатки возникают в центре сетчатки близко к зрительному нерву в постнатальный день 0 (Р0), а также разработать ангиогенезом с образованием сильно организоватьD сосудистого сплетения, которое достигает периферии сетчатки примерно на ⁵ P8. Кровеносные сосуды развивать характерным образом с капиллярной сплетение постепенно возрастает в направлении от диска зрительного нерва к периферии, чтобы генерировать регулярное чередование артерий и вен с промежуточным капиллярной сети. Сосудистой сети сетчатки обеспечивает идеальную модель для изучения ангиогенеза как сосуды могут быть легко идентифицированы, как они растут в том, что по существу является 2D плоскости, что делает его относительно легко изучить сосудистой сети сетчатки в плоской горы препаратов ^5. Способ выделения мышью сетчатки новорожденных для анализа эндотелиальные клеточные ответы опрокинуться естественных условиях несколько часов бывший сообщалось ^6. Кроме того, более детальное исследование всей сосудистой сети сетчатки и связанные с ними сосудистые маркеры требует иммуноокрашивания фиксированных экземпляров сетчатки на разных стадиях развития.

Здесь мы предлагаемПодробное описание надежный и технически прямой метод, который мы используем для целом окрашивания горе мышиных сетчатки сосудистого сплетения, от начального энуклеации послеродовой глаза (см. также ⁷⁾ через протоколы окрашивания до конечного изображения под микроскопом.

Protocol

Все стадии проводили при комнатной температуре, если не указано иное. 1. Энуклеация и фиксации Послеродовая Глаза Наведите мышь умерщвлены гуманным щенка на бок, снимите кожу, покрывающую глаз с помощью ножниц. Используйте ножницы и щипцы, чтобы выяснять глаз….

Representative Results

После вскрытия сетчатки должна выглядеть плоской цветок (рис. 1). При использовании протоколов, описанных выше, эндотелиальные клетки можно увидеть, используя isolectin B4-Alexa488 окрашивания и поддержки сосудистых клеток мышц визуализировали с использованием анти-альфа-актин гладки?…

Discussion

Изложенный здесь метод предлагает простой и эффективный способ получения изображения из цветного целом препараты горе сетчатки новорожденных мышей, что делает его легко поддаются количественной оценке и физиологически соответствующие модели ангиогенеза. Первоначально, мышь глаз м?…

Materials

			Material
Plastic pipettes 3 ml	Scientific Laboratory Supplies	PIP4210	Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates	Scientific Laboratory Supplies	353226
Select Petri dishes TV 90 mm	Scientific Laboratory Supplies	SLS2002
Histobond slides	VWR	631-0624
Coverslips 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Tweezers #5	World precision instruments	14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades	World precision instruments	501235	Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	500086	Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	501778	Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml	Starlab	E1420-2000
			Reagents
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876	PBS reagent
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	PBS reagent
Sodium chloride	Sigma	S9625	PBS reagent
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Donkey serum	Sigma	D9663
Goat serum	Vector	S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36930	Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Use at 1:200 dilution
			Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal )	Millipore	AB5320	Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)	Millipore	MAB360	Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)	Millipore	04-585	Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )	Chemicon	AB756P	Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)	Sigma	C6198	Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550546	Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)	BD Pharmingen	553370	Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550548	Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal)	R&D Systems	AF770	Detects endothelial cells
			Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488	Invitrogen	A11006	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594	Invitrogen	A11007	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488	Invitrogen	A11029	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594	Invitrogen	A11058	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
			Microscopes
Dissection microscope	Zeiss	Stemi SV6
Camera	Zeiss	Axiocam HRc	Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope	Zeiss	Axioimager with Apotome
Camera	Zeiss	Axiocam HRm	Camera for Axioimager
Confocal Microscope	Nikon	A1R