Mont entiers immunofluorescence de la rétine de souris néonatal chargé d'enquêter sur l'angiogenèse<em> In vivo</em

Summary

La rétine murin néonatal fournit un modèle physiologique bien caractérisé de l'angiogenèse, qui permet à des enquêtes sur les rôles des différents gènes ou des médicaments qui modulent l'angiogenèse dans un<em> In vivo</em> Contexte. Immunofluorescence de visualiser avec précision le plexus vasculaire est essentielle à la réussite de ce type d'études.

Abstract

L'angiogenèse est le processus complexe de la formation de nouveaux vaisseaux sanguins défini par la germination de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants. L'angiogenèse joue un rôle essentiel non seulement dans le développement normal des organes et des tissus, mais aussi dans de nombreuses maladies dans lesquelles la formation de vaisseaux sanguins est déréglée, comme le cancer, la cécité et les maladies ischémiques. Dans la vie adulte, les vaisseaux sanguins sont généralement repos si l'angiogenèse est une cible importante pour le développement de médicaments nouveaux pour essayer de réguler la formation de nouveaux vaisseaux spécifiquement dans la maladie. Afin de mieux comprendre l'angiogenèse et d'élaborer des stratégies appropriées pour réglementer cela, les modèles sont nécessaires, qui reflètent avec précision les différentes étapes biologiques qui sont impliqués. La rétine de la souris néonatale constitue un excellent modèle de l'angiogenèse, car les artères, les veines et les capillaires se développent pour former un plexus vasculaire au cours de la première semaine après la naissance. Ce modèle a également l'avantage d'avoir un deux-didimensionnelle (2D) la structure qui rend l'analyse directe par rapport à l'anatomie 3D complexe d'autres réseaux vasculaires. En analysant le plexus vasculaire rétinienne à différents moments après la naissance, il est possible d'observer les différentes étapes de l'angiogenèse sous le microscope. Cet article montre une procédure simple pour analyser la vascularisation de la rétine de la souris en utilisant une coloration fluorescente avec des anticorps spécifiques isolectine et vasculaire.

Introduction

L'angiogenèse est un processus complexe du développement définie par la formation de nouveaux vaisseaux sanguins à partir d'un réseau de vaisseaux préexistants et est réglementé par plusieurs voies de signalisation. Le plus important d'entre eux est la voie du VEGF. VEGF est libéré par les cellules ischémiques et conduit à l'initiation de la germination angiogénique dans les vaisseaux sanguins avoisinants. Les cellules endothéliales de premier plan à partir d'une nouvelle pousse vasculaire est une cellule «pointe», qui produit filopodes qui atteignent en direction de la source de VEGF, et est suivie par des cellules endothéliales proliférantes "tige". De cette façon, les cellules endothéliales activées migrent et prolifèrent vers une région avasculaire où ils forment de nouveaux tubes vasculaires. Afin de stabiliser ces tubes pour soutenir la circulation sanguine, les cellules endothéliales interagissent avec les péricytes et les cellules musculaires lisses qui entourent les nouveaux vaisseaux sanguins ^1. L'angiogenèse est essentielle pour la vascularisation de l'embryon et des tissus en croissance. Cependant, il contribue également à de nombreux pathologiqueques troubles tels que le cancer, tandis que les défauts de l'angiogenèse sont associés à des maladies ischémiques. Le développement de traitements médicamenteux efficaces pour réguler l'angiogenèse comme un moyen de traiter la maladie est donc d'un grand intérêt. Par exemple, les facteurs anti-angiogéniques efficaces réduiront la croissance du cancer, tandis que les stratégies pro-angiogéniques peuvent être utilisés pour traiter la maladie ischémique. Ainsi, les modèles d'angiogenèse sont essentielles pour mieux comprendre la régulation de la formation de nouveaux vaisseaux et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer ou diminuer la croissance vasculaire.

Un élément fondamental de la recherche sur l'angiogenèse est le choix d'un modèle vasculaire approprié. Plusieurs modèles in vitro ont été conçus pour reproduire les étapes de base de l'angiogenèse tels que la migration cellulaire endothéliale, la prolifération et la survie ^2,3. Un fréquemment utilisé dans l'essai in vitro est la formation d'un réseau ramifié de cellules endothéliales sur une matrice de Matrigel, même si tson n'est pas spécifique des cellules endothéliales, ni intègrent généralement le soutien de péricytes ou des cellules musculaires lisses. L'évaluation de l'angiogenèse germination ex vivo à l'aide de cultures d'organes de souris telles que le dosage de corps embryoïdes, le dosage de l'anneau aortique et le dosage du métatarse foetal permet l'analyse de l'angiogenèse des cellules endothéliales dans le cadre de cellules de soutien supplémentaires. Cependant, les principales limites de ces essais comprennent le manque de flux sanguin et la régression des navires de plus de temps, ce qui donne une fenêtre limitée pour l'analyse. Par conséquent, pour comprendre la régulation de l'angiogenèse avec plus de précision, dans des modèles in vivo sont nécessaires tels que ceux développés chez la souris en utilisant des éponges sous-cutanée implantés ou des bouchons matrigel, ainsi que le modèle d'ischémie des membres postérieurs. Cependant, ces modèles sont difficiles à analyser en raison de l'architecture 3D complexe du néovaisseaux. En revanche, l'embryon de poisson zèbre s'est avéré un excellent modèle pour l'angiogenèse visualiser dans l'ensembleorganisme ^4. Toutefois, la souris est évolutif beaucoup plus étroitement lié à l'homme que le poisson-zèbre, rendant le modèle préféré dans de nombreux cas la souris. Par conséquent angiogenèse de la rétine postnatal de la souris représente une méthode bien caractérisé de choix pour la recherche sur l'angiogenèse. Il fournit non seulement un paramètre physiologique, mais aussi un plexus vasculaire 2D qui peuvent être facilement visualisées en utilisant des colorants fluorescents appropriés. L'architecture du réseau de vaisseaux, de la prolifération endothéliale, la germination, le recrutement des cellules périvasculaires et le remodelage vasculaire peuvent tous être étudiée en utilisant cette technique.

Dans la rétine néonatale de la souris, le développement des vaisseaux sanguins de la rétine se produit dans la première semaine de vie postnatale. Souris, contrairement aux humains, naissent aveugles et les rétines ne deviennent vascularisée après la naissance. Vaisseaux rétiniens surgissent du centre de la fermeture de la rétine au nerf optique à jour postnatal 0 (P0), et se développent par l'angiogenèse pour former un très organisentd plexus vasculaire qui atteint la périphérie de la rétine d'environ ⁵ P8. Les vaisseaux sanguins se développent d'une manière caractéristique avec le plexus capillaire croissant progressivement vers l'extérieur du disque optique vers la périphérie pour générer un modèle alternatif régulier des artères et des veines avec un réseau capillaire d'intervenir. La vascularisation rétinienne est un modèle idéal pour étudier l'angiogenèse que les navires peuvent être facilement identifiés à mesure qu'ils grandissent dans ce qui est essentiellement un plan 2D, ce qui rend relativement facile d'examiner la vascularisation rétinienne dans les préparations plate-montage ^5. Procédé pour isoler la rétine néonatale de la souris pour l'analyse des réponses des cellules endothéliales de bout de plusieurs heures ex vivo a été rapporté ^6. Sinon, un examen plus détaillé de l'ensemble du système vasculaire rétinienne et des marqueurs vasculaires associées nécessite immunologique des spécimens de la rétine fixes à différents stades de développement.

Ici, nous fournissonsune description détaillée d'une méthode fiable et techniquement simple que nous utilisons pour toute coloration de montage de la murine rétinienne plexus vasculaire, de l'énucléation initiale de l'œil postnatal (voir aussi ⁷⁾ à travers les protocoles de coloration à l'imagerie finale sous le microscope.

Protocol

Toutes les étapes sont réalisées à température ambiante, sauf indication contraire. 1. Énucléation et la fixation des Yeux postnatale Placez la souris euthanasiés chiot de son côté, enlever la peau qui recouvre l'œil avec des ciseaux. Utilisez des ciseaux et des pinces pour énucléer l'œil. Placez les ciseaux sous l'œil énucléé, couper le nerf optique et des tissus environnants et soulever l'œil. Transfert à une plaque de 24 p…

Representative Results

Après dissection de la rétine devrait ressembler à une fleur plat (Figure 1). En utilisant le protocole décrit ci-dessus, les cellules endothéliales peuvent être vus à l'aide isolectine coloration B4-Alexa488 et en soutenant les cellules musculaires vasculaires sont visualisés à l'aide anti-alpha actine musculaire lisse (Figure 2). Le point de vue de faible puissance utilisant un objectif 5X dans la figure 2 permet une vue d'ensemble de l'organi…

Discussion

La méthode présentée ici offre un moyen simple et efficace pour obtenir des images de préparations colorées de montage entières de rétines de souris néonatales, ce qui en fait un modèle facilement quantifiable et physiologiquement pertinents de l'angiogenèse. Initialement, l'œil de la souris peut être assez difficile à disséquer en raison de sa petite taille et la forme du globe, alors un peu de pratique et de bons outils de dissection sont nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Dissecti…

Materials

			Material
Plastic pipettes 3 ml	Scientific Laboratory Supplies	PIP4210	Remove tip with scissors to create a wide bore
BD Falcon 24-well plates	Scientific Laboratory Supplies	353226
Select Petri dishes TV 90 mm	Scientific Laboratory Supplies	SLS2002
Histobond slides	VWR	631-0624
Coverslips 22 x 22 mm	VWR	631-1336
Dumont Tweezers #5	World precision instruments	14095
Spring scissors 10.5 cm long, with straight 8 mm blades	World precision instruments	501235	Used for enucleation
Vannas scissors 8.5 cm long, with straight 7 mm blades, and 0.025 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	500086	Used for dissecting retina
Superfine vannas scissors 8 cm long with straight 3 mm blades, and 0.015 x 0.015 mm superfine tips	World precision instruments	501778	Used for dissecting retina
crystal clear’ tubes 2 ml	Starlab	E1420-2000
			Reagents
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876	PBS reagent
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655	PBS reagent
Sodium chloride	Sigma	S9625	PBS reagent
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Make up in 2x PBS and store at -20 °C
BSA	Sigma	A7638
Triton X-100	Sigma	T9284
Donkey serum	Sigma	D9663
Goat serum	Vector	S-1000
Prolong Gold anti-fade reagent	Invitrogen	P36930	Mounting reagent
Isolectin GS-IB4-alexa 594	Invitrogen	I21413	Use at 1:200 dilution
Isolectin GS-IB4-alexa 488	Invitrogen	I21411	Use at 1:200 dilution
			Primary Antibodies
Anti-NG2 (rabbit polyclonal )	Millipore	AB5320	Detects pericytes
Anti-GFAP (clone GA5, mouse monoclonal)	Millipore	MAB360	Detects astrocytes
Anti-Desmin (clone Y66, rabbit monoclonal)	Millipore	04-585	Detects pericytes
Anti-Collagen IV (rabbit polyclonal )	Chemicon	AB756P	Detects vascular basement membrane
Anti-alpha smooth muscle actin-Cy3 (clone 1A4, mouse monoclonal)	Sigma	C6198	Detects vascular smooth muscle cells.
Anti-Endoglin (clone MJ7/18, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550546	Detects endothelial cells
Anti-CD31 (clone MEC13.3, rat monoclonal)	BD Pharmingen	553370	Detects endothelial cells
Anti-VE-Cadherin (clone 11D4.1, rat monoclonal)	BD Pharmingen	550548	Detects endothelial cell junctions
Anti-Alk1 (goat polyclonal)	R&D Systems	AF770	Detects endothelial cells
			Secondary Antibodies
Goat anti-rabbit-Alexa594	Invitrogen	A11012	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa488	Invitrogen	A11006	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-rat-Alexa594	Invitrogen	A11007	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Goat anti-mouse-Alexa488	Invitrogen	A11029	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
Donkey anti-goat-Alexa594	Invitrogen	A11058	All secondary antibodies are aliquoted immediately on arrival and stored at -20 °C.
			Microscopes
Dissection microscope	Zeiss	Stemi SV6
Camera	Zeiss	Axiocam HRc	Camera for dissection microscope
Epifluorescent Microscope	Zeiss	Axioimager with Apotome
Camera	Zeiss	Axiocam HRm	Camera for Axioimager
Confocal Microscope	Nikon	A1R