获取标本减慢，加速和反老化的蜜蜂型号

Summary

在蜜蜂的工人，老化依赖于社会行为，而不是实际年龄。在这里，我们将展示如何工人种类具有非常不同的老化模式可以得到和细胞衰老分析。

Abstract

高度社会化的动物的社会功能密切相关的个体之间的广袤的寿命差异。其中社会性昆虫，蜜蜂是最好建立的模型，以研究如何可塑性寿命和衰老是由社会因素来解释。

蜜蜂的工人等级包括护士蜜蜂，这往往育雏，并采集蜜蜂，负责收集花蜜和花粉。以前的工作表明，大脑功能和飞行性能的征粮衰老的速度比护士。然而，大脑的功能可以恢复，觅食时恢复到哺乳的任务。加快并逆转衰老的功能，例如模式都与代谢改变资源水平，在蛋白丰度的改变和免疫功能。卵黄，卵黄蛋白与激素控制和细胞防御适应功能，可作为中，控制工人的不同老化动力学网络的主要调控元件。

在这里，我们描述了如何护士和觅食的出现可以被监控，和操作，包括逆转，从典型的短命觅食成更长寿命的护士。我们的代表结果表明，与同类实足年龄个体如何分化成蜂和护士蜜蜂实验条件下。我们举例说明如何行为逆转，从觅食回到护士可以进行验证。最后，我们显示如何不同细胞衰老可通过测定脂褐质的积聚，衰老的普遍的生物标记物进行评估。

为了研究可能连结社会影响的机制和老化的可塑性，该协议提供了一个标准化的工具集，以获取有关样品材料，并提高未来的研究中数据的可比性。

Introduction

高度社会化的动物的复杂的菌落结构通过生殖种性的相互作用维持，并且通常是非再现工人的辅助阶级不同社会任务的行为。在不同的工人，具体的生理适应性使不同的同胞关心的行为，也与极端的寿命差异。蜜蜂和鼹鼠代表了最发达的动物模型，研究如何社会性链接到的加速，可以忽略不计或逆转老化的^1-3模式。

在蜜蜂的殖民地，一个产蛋女王是由成千上万的工人，往往育雏，饲料的粮食援助，并参与防守，体温调节或卫生行为^4。在这些工人中是极其短暂的征粮，护士蜜蜂与中间，和冬季（diutinus）与蜜蜂的寿命最长。个人，但是，不会永久绑定到一个特定的窝rker型，但会显示一条灵活的行为个体发育：他们从一个社会任务的行为更改为另一种（“时间种姓”）。乳臭未干的蜜蜂可以换到育雏抚育护士蜜蜂，最终可能会改变外界觅食。然而，乳臭未干巢蜜蜂也可以变身为最长寿的冬季蜜蜂和短命觅食，甚至可以恢复到通常寿命更长护士。极端（冬季蜜蜂）和中级（保姆蜂）寿命工人有发达的食品生产和贮藏器官与丰富的资源-而不是短暂的觅食^（1,5审查）。然而，个人寿命的调节超越于个人的资源平衡简单的修改建议通过在卵黄蛋白，它具有不同的适应功能，在非再现工人等级，比如果冻生产^6，激素控制^7，免疫研究^8，抗氧化剂防御^9。

的f模式unctional下降（衰老）工人镜的寿命差距，为建立嗅觉，同时还为其他脑或运动功能^10-13。具体地，仅在两个星期的觅食之后的显著下降学习函数相匹配类似的死亡率级数中觅食^14，相对于缺乏可检测的下降（可忽略衰老）的长寿命的冬季蜜蜂^15。

为了确定我们适应建立实验范式，使监测和处理老化型转变^8,16,17灵活衰老的分子指纹。实验1的详细信息如何获取样品中的实足年龄和老龄工作者类型的具体的社会行为的影响可以分开。实验2描述了征粮与加速进入护士蜜蜂与减缓老化动力学的逆转。实验3提供了解剖学探测细胞衰老的影响的方法已建立的生物标志物细胞衰老（脂褐素^）18升量化。

Protocol

1。从实际年龄衰老脱钩

本节介绍的双队列的殖民地，它包括确定个人共享同一个实足年龄（“单年龄组”）和巢蜜蜂的队列的队列的设置。单年龄组的同年龄人最终会分成不同的工人类型不同老化动力学 - 这些都是护士与蜜蜂放缓，采集蜜蜂与加速功能下降。所有的程序都描述一个实验殖民地。然而，我们建议，进行实验用于至少两个菌落复制，使细胞集落的影响可以被控制为（2 - 复制 - 设计）。

1. 准备蜂巢箱为双队列殖民地：准备一台普通的蜂巢框，接收两个食品梳子蜂蜜，花粉另一种食物梳子，和两个空的梳子。一定要找到一个交配女王，以及一个供体的殖民地超过3,000窝蜜蜂。双方将在后面介绍（1.3）。
2. 获取和标记相似的实足年龄人士：收集梳子与密封育雏，即将涌现。对于一个复制预期收回梳子总3,000-5,000上限育雏细胞。对于每个复制使用育雏的平衡量从至少三个不同的蜂巢来源，以避免母体基因型（蜂巢原点）的偏斜分布。
   1. 将育雏梳子在孵化器设定为34℃，60％-70％的相对湿度。确保存储梳子以这样一种方式，新兴育雏无法逃脱。
   2. 让蜜蜂出现两天并与胸廓（ 如统一POSCA，三菱铅笔有限公司）小漆标签标记这些蜜蜂。油漆标记将允许识别单个年龄组（出苗天）的蜜蜂，并从其他重复的菌落区别开来。
3. 设置一个双队列殖民地，包括i的队列dentified，单身年龄蜜蜂：在一天年轻的蜜蜂已经被标记，收集从捐赠者的殖民地约2500-3000巢蜜蜂（比较第1节中讨论。），并添加这些标记的蜜蜂来之前准备了蜂巢箱（见步骤1.1）。后者个人将构成不明巢蜂队列。
   1. 添加王后，这将是最初仅限于女王笼（市售）。密封笼食用糖果（ 如 Apifonda，Südzucker公司，曼海姆/ Ochsenfurt，德国），使工蜂慢慢松开女王。
   2. 添加新出现的和显着的蜜蜂，这将构成一个年龄组。这些蜜蜂是唯一显着的个体，并为以下所有步骤的焦点小组。
4. 监测发病觅食和标记征粮：为了评估发病和护士对觅食的单年龄组的过渡动态，监测觅食活动辰人口统计发展很一天每个殖民地。开始计数5天后菌落进行设置（ 图1）。
   1. 计数蜜蜂从内按固定时间3×20分钟观察期间觅食航班（入口计数）返回的总数。请务必在定向航班期间不计蜜蜂（见讨论）。
   2. 当入口计数表明相当觅食活动开始（> 100入口数/天），开始标记觅食。要做到这一点，单年龄组（单标记个体）的觅食后，收到来自他们的第一觅食航班返回第二个油漆标记。这个标志漆将指定觅食发病的当天，并且将允许以后识别觅食年龄每觅食。
   3. 每日重复标记直到蜜蜂足够数量的已标记。用于估计标记觅食足够数量的，期望的不超过5％-10％的检索率这些蜜蜂已经老化后，通常经过14天觅食。
5. 取样：由于所有的初始标记蜜蜂具有类似的实足年龄，护士和老觅食的年龄匹配的基团，可以同时采集，当觅食觅食已为≥14天。
   1. 单标记的护士蜜蜂蜂房内收集，并通过护理行为（喂食和清洗幼虫在开放育雏细胞放下头）确定。
   2. 双标征粮也收集蜂巢内每天觅食活动开始之前。
   3. 收集蜜蜂提供充足的通风笼（管，盒），并保持黑暗，直到进一步的处理。另外，对于转录组，表观遗传或蛋白质组学研究，直接扣在液氮中冷冻蜜蜂。收集个人的均衡数量从所有测试组和复制的殖民地。

2。与快速与缓慢老化工人工人通过改变蜂房的人口<逆转/ P>

本节详细介绍如何逆转，从工人的加速老化（觅食）工人与减缓老化（护士蜜蜂）执行。这种行为逆转诱导，觅食时遇到一个缺乏护士的蜜蜂，通常从事育雏舍。在回归过程将分离的单个菌落复制成两个蜂箱：一个配置单元的护士蜂分数（“护士衍生”），另一个与觅食分数（“觅食来源”）。后成功逆转，塑料可能出现的症状和逆转衰老可以研究在单一年龄组与恢复工人，继续征粮，持续护士蜜蜂和新招募的觅食。和以前一样，确定了单年龄组，而不是不明巢蜜蜂队列的蜜蜂，构成了实验焦点小组。

1. 制备方法：复制荨麻疹护士（单标）和征粮（双标）是在上一节中所述提供。确保不复归开始，每个重复菌落小于500标觅食，以确保有足够的检索复归完成后。
   1. 逆转后的安全鉴定测试组的关键是整个觅食人口在原来的蜂巢已经回归之前被标记为关闭。下面的步骤描述为一个复制。
   2. 回归前一天，准备一个额外的蜂巢箱为觅食衍生蜂房（见步骤1.1）。找到两个皇后和两个育雏梳子捐助荨麻疹。转移到实验前殖民地刷了所有的成年蜜蜂从这些梳子。一笼女王（见步骤1.3），以及一个育雏梳将在原有的蜂巢箱代替女王和育雏梳子。另一组的女王和育雏梳将要使用的第二天新蜂巢框。新的育雏梳子和外来皇后两个，原来和新蜂巢建议，以确保类似的分配分开觅食和护士s将会同样经历改变了蜂房线索（“蜂巢闻”）。
2. 逆转：早晨，就在回归前，笼女王和育雏梳添加到新的方块，将接收觅食衍生部分。等到觅食高峰时开始。然后将原来的殖民地注明来源为觅食和护士的蜜蜂至少有100米的距离原来的位置。
   1. 在原来的位置上，建立了觅食来源的蜂房与育雏，只有女王的新盒子。
   2. 征粮将离开原脱臼蜂巢框，头回原来的位置。允许觅食返回到2小时的原始位置，以达到下一个完成觅食人口从巢蜂分离。
   3. 然后，终止分离，关闭掉原来的，现在的“护士衍生的”配置单元，它至少有3公里远转移到一个养蜂场。
3. 蜂巢维护和监控对于成功的社会任务反转：定期检查实验荨麻疹健康，开放的育雏。
   1. 在殖民地操纵后的第一天更换无人值守和死育雏，以减少潜在的病原体负荷。
   2. 为了验证成功逆转的觅食来源的蜂房内，采取育雏梳子的图片介绍这些之前，再次当梳子被替换或者当复归试验完成（ 图2）。与以前不封顶的育雏和开放，现场育雏区域是护理活动中觅食的集落可靠标记。
4. 采样：觅食和护士后3-8天可以检测伴随社会反转生理效应分离。
   1. 我们建议所有取样试验组， 即恢复工人和持续觅食（觅食衍生蜂巢），以及持续的护士和新招聘的觅食（护士衍生蜂巢）8日内开始逆转后。
   2. 关口如步骤1.5中所述课样品。

3。由脂褐质的定量分析工型特异性细胞衰老模式

脂褐质是细胞衰老的一个普遍的生物标志物。作为一个内在的累积产物，脂褐质的特定的自体荧光（发射_最大 = 530-650纳米），可用于检测^18。

1. 解剖和固定：冰上冷藏蜜蜂，直到一动不动，删除并剖析出所需的组织样本。
   1. 在4℃下过夜孵育;转移到固定剂（pH 7.2的4％多聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水，PBS）中
   2. 在PBS中洗涤样品3次。
2. 组织处理和安装：通过使用振动切片机刀片， 例如莱卡VT 1000S（徕卡生物系统公司，旅游Nussloch，德国）切割的组织样品与不超过40微米厚的切片，例如。
   1. 安装在显微镜玻片切片在50％甘油（PBS）中。对于长期储存密封盖玻片指甲油。
3. 图像采集：为了检测脂褐素，我们建议使用激光扫描共聚焦显微镜，提供激光线，λ= 514，561nm或类似的激励，并与探测器的带宽设置为570-650纳米。
   1. 为了更好地识别脂褐素，包括第二通道，并做了同步扫描在更短的波长光谱（激发= 405 nm处;排放量= 410-450纳米）。较长波长信道将揭示两者，脂褐素颗粒，但也非特异性的“背景”，由于自身荧光气管等非粒状结构。第二，较短的波长信道将只显示非特异性自体荧光，但不脂褐素。因此，脂褐素标识可以是facili通过比较两个通道的信号，只有其中一人流露颗粒与脂褐素特异性荧光tated。
   2. 对采集的高分辨率图像使用目的与40X放大率或更高，以及1.25或更高优选的数值孔径。扫描图像叠加约100×100×10μm的^3个维度。每一个个人和组织样本必须由多个图像堆栈来表示。
   3. 为了减少因技术变化个体内和个体间变异，始终保持激光功率和探测器灵敏度恒定。
   4. 由一天到一天的技术变化减少偏见扫描每个数扫描会话的所有测试组的相等样本数。
4. 图像处理：使用软件包的模块，允许对显微图像堆栈先进的加工，例如ImageJ的（健康，马里兰州贝塞斯达，美国美国国家研究院​​，gej.nih.gov / IJ /“目标=”_blank“> http://imagej.nih.gov/ij/）。
   1. 生成一个二维最大投影为每个3D图像堆栈。
   2. 为了衰减高频噪声，并保持结构与脂褐素颗粒的尺寸适用于一个高斯滤波器具有适中的籽粒大小。
   3. 合并两个颜色通道，以方便识别脂褐素（见步骤3.2）。
5. 图片分析：确保执行量化步骤的主题将是盲目的测试群体认同。
   1. 对于所有的图像，先选择感兴趣区（ROI），涵盖了相关结构，并具有类似的尺寸从其他图像中感兴趣区域的区域。
   2. 然后选择代表每个ROI脂褐素颗粒的期望数量。当选择一个ROI内脂褐素颗粒，下列规则的应用将减少主观偏见。
      1. 选择一致的位置，用于选择所述第一麻粒乐。这可以是，例如，一个ROI的最左边，并且该颗粒是最接近的边缘将始终是第一选择。
      2. 此起彼伏，颗粒选择是最接近先前的选择（下一个邻居）。
      3. 当选择一个邻居，只移动到一个方向，例如只能从先前的选择搜索的权利。这条规则可以防止该评选是由密密麻麻的颗粒偶尔集群为主。
      4. 当选择完成后，通过概述和测量各颗粒面积评估每个脂褐素颗粒的大小。使用适当的统计测试，以比较不同的测试组的个体。

Representative Results

协议第1和2详细测试组如何能够获得学习的加速属性，减缓和扭转与一个单一的年龄组菌落老化。为了监视工人型分化，伴随着个体发育正常，我们评估觅食计数（“高考计数”）的6个菌落（ 图1，比较第1节）。该图显示，通常观察不到从护士相当大的变化的觅食状态前的人更超过10天。在觅食计数标记变异观察与问候觅食不同群体之间发生的时机，作为一个显着的一天到一天的每一个菌落内变化。除了 ​​殖民地特定的人口因素，如不同的育雏负载，多变性，通过改变天气状况（红色标记在图1的时间点）解释。密切监测觅食动力学，因此建议以优化标记和收集工作DURing的实验。

从觅食回到护理任务的逆转个体发育（第2节）可以通过检查被引入到觅食的集落育雏梳进行验证（见步骤2.2和2.3）。对于三个重复图2A，C和E展会育雏梳子引入觅食的集落之前。 图2B，D和F显示了各自的梳子去除后。新上限育雏，健康的幼虫，并围绕育雏细胞增多花粉贮藏的补丁表明，前者征粮现在已经成功执行的典型巢，包括护理任务。

脂褐质（第3节）是细胞衰老的一个高度保守的症状，并且可以容易地评估后的实验分析中的各种蜂组织， 图3的对比脂褐质积聚，测量颗粒尺寸（ 图3E），在该下咽腺年龄匹配的护士ND采集蜜蜂。这两个年轻人和两个老组之间的实足年龄差异≥17天，只有一组（觅食）花这些≥17天与外界的飞行和食物采集活动。代表性的显微图像（ 图3A-D）秀后17天以上觅食（ 图3D）的增加只为一群年长征粮脂褐素的积累，而不是类似的实足年龄较老护士蜜蜂（37-43天; 图3B） 。一个双因子方差分析与固定主要因素工作者式（征粮，护士）和年龄差异（Δage≥17天）透露了工人类型，年龄差异和（F _型 = 33.67，P这两个因素之间的相互作用显著作用_{<0.001，FΔage=} 21.93，P <0.001，F _型×Δage= 22.07，P <0.001）。然而，事后试验表明显著作用仅对比旧的征粮（觅食≥17天）时，年轻的觅食，或两者兼施护组（PF 17D主场迎战f _1d/N1d/N17d <0.001，Fisher的LSD， 图3E）。无差异后3组，按时间顺序包括年轻人和老年人的护士群体（; 图3E以P所有测试> 0.5，Fisher的LSD）中检测到。这表明，脂褐素的积累依赖于特定的觅食活动（觅食岁），而不是实际年龄的唯一功能本身。

图1。正常个体发育过程中，工人型分化。征粮从计数6个不同的殖民地开始5天成立后，他们觅食的航班回国的图显示入口计数（详细比较协议第1.4节）。从NE相当大的转变ST觅食活动是首次观察到单年龄组的个人标记分别约为10天。对于累积入口处计数变化的斜坡表明，护士蜜蜂来觅食过渡的动态殖民地之间的不同，以及受气候因素。例如，在有雨和不到两个小时觅食的日子，增加入口数通常夷为平地（数据点为红色）。

图2。验证行为的回归。要测试征粮已经成功地恢复到护理工作中，我们比较育雏梳，才引入觅食源性荨麻疹，并从这些蜂箱被拆除后，他们。代表图像显示育雏梳子引进前（A，C，E）和从三个不同的觅食源性荨麻疹，分别去除（B，D，F）之后。育雏舍由以前的采集蜜蜂被越来越多的细胞与育雏上限（B，D，F，黑色箭头，在插页D）表示，持续的幼虫在公开细胞（红色箭头）的生存和花粉增加的存储接近育雏细胞（白色箭头）。需要注意的是觅食衍生殖民地初期通常效率较低，在抚育育雏比护士的集落。这可能导致在觅食衍生基菌落更高幼虫死亡率。图片在B，D，F取5，后4天和7天的育雏梳子引入觅食的集落。

图3。积聚的脂褐质的，细胞的生物标记ular衰老，可以指示工人型特异性组织恶化。在年轻的（A）咽部腺体代表显微图像和老护士蜜蜂（B），以及在年龄匹配的采集蜜蜂与≥1天（C）分别为≥ 17天觅食经验（在A = 20微米比例尺）。脂褐质的积聚，测定如颗粒大小，并给定为中位数和四分位数为每个年龄和工人式（E）N = 5的个人。觅食了17天带来显著的脂褐质的积累，而同一时期并没有导致护士蜂脂褐质的变化（见统计结果）。

Discussion

在这里，我们采用前面所述的方法^{8,16,17,19,20，}并将它们集成到一个单一的工作流程，这将有利于灵活学习老龄化蜜蜂。我们的目标是为科学家是新手，这个领域与标准化的工具集，以取得相关样本材料，并改善不同的研究小组之间的实验重现性。虽然我们的程序简化，不需要特殊设备，在前面的描述（比较例如^8），预防的一些措施，建议及以下收集。

从实际年龄衰老的解耦，一个最重要的方面，就是要避免觅食行为（ ^第二标）初始确认时采集蜜蜂的误识别。因此，当征粮要监视（“高考罪状”）或标记，并严格避免日常期间与方向的航班。在此期间许多预先论坛更改阶段蜜蜂将离开或进入蜂房。这些蜜蜂不显示成熟征粮典型的生理特点，但通过易于识别圆形飞行模式²¹建立蜂房周围的空间地图。

虽然大多数蜜蜂改变与2周及以上年龄觅食，觅食零星是在非常年轻的年龄已经观察到（ 图1）。极早熟觅食通常直接从乳臭未干的巢蜜蜂发展离不开通过护士的阶段已经过去了。不包括与这样的个体发育异常（比较²²和参考文献）个人，开头为10天或以下的年龄觅食个人不视为作进一步分析。

为了进一步避免早熟征粮的人数过多，我们不使用传统的“单队列殖民地”只有一个年龄组^17,23的那个组成。相反，设置时我们添加随机巢蜜蜂（“鸟巢蜜蜂世代”）的标单年龄组的菌落（见步骤1.1和1.3）。由于随机巢蜜蜂通常是年纪大了，他们可以减少对非常年轻的蜜蜂的压力，发展成极为早熟征粮^17。这种双队列的殖民地，因此，可以更好地像一个天然蜂房人口与个人，从护理进展缓慢觅食。

当长期工人具体的修改是需要研究，收集所有测试组外觅食小时。这是告知更多急性代谢调整，以减少偏见，由于最近的自发活动，例如耗尽飞行。

工人快速逆转衰老放慢通过改变配置单元的人口。后征粮已经飞回原来的位置，必须搬开护士衍生蜂房（> 3千米）。这是为了避免前期觅食的蜜蜂阶段招募并引导到旧位置由其他蜜蜂，分别通过信息素通讯^24。

为了进一步防止任何护士或其他预觅食的个体进入觅食衍生蜂房，我们建议符合下列规定：（i）终止分离过程之前，每天的航班方向开始。 （二）只有试图逆转时，强烈的觅食活动观察几天。 （三）期间和之后原蜂巢的初步易位，避免蜜蜂不必要的躁动，尤其是不要打开蜂箱。

原则上，限制在觅食护士剥夺环境更加人为的设置也可能导致逆转。然而，这样的设置只有有限的参考价值，为觅食衍生部分经验等紧张的环境，从而排除与护士的集落对照组进行直接比较。

确定不同的衰老模式由脂褐质的量化，细胞衰老的生物标志物。在这里，我们举例说明脂褐素评估，图像和下咽腺的统计数据，因为脂褐素是最容易被检测到这个组织。因此，我们认为，重要的是要帮助没有经验的观察员设立的微观检测正确的协议。然而，与其他组织，下咽腺做护士期间显示显著凋亡和坏死觅食过渡^25。这样的过程可能与衰老标志物堆积相互作用，即使我们没有发现在最近已经从护理工作（ 图3C，E），改变了年轻的征粮脂褐素水平的提高。但是，为了评估在其它蜂组织衰老的措施，这里所描述的显微镜为基础的方法可很容易地适应。

可替换地，流式细胞方法是耗时更少^26。显微镜为基础的分析具有的优点是蜂窝老化的症状可评估为不同的区域或什至在一个单一的器官²⁷细胞。在大脑和其他器官的复杂与空间异质性细胞衰老^28项研究，因此，我们建议根据显微镜的方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000