La obtención de especímenes con desacelerado, acelerado y Invertida Envejecimiento en la abeja de la miel Modelo

Summary

En los trabajadores de abejas, el envejecimiento depende de los comportamientos sociales, más que en la edad cronológica. Aquí se muestra cómo se pueden obtener y se analizó la senescencia celular trabajadores-con tipos muy diferentes patrones de envejecimiento.

Abstract

Sociedades de animales altamente sociales cuentan con grandes diferencias de vida útil entre individuos estrechamente relacionados. Entre los insectos sociales, la abeja de la miel es el mejor modelo establecido para estudiar cómo la plasticidad en la vida útil y el envejecimiento se explica por factores sociales.

La casta de obreras de las abejas melíferas incluye las abejas nodrizas, que tienden la cría y abejas para cosechadoras de forraje, que recogen el néctar y el polen. Trabajos anteriores han demostrado que las funciones del cerebro y el rendimiento de vuelo envejecen más rápidamente en los cazadores-recolectores que en las enfermeras. Sin embargo, las funciones del cerebro pueden recuperar, cuando recolectoras vuelven a sus tareas de enfermería. Estos patrones de senescencia funcional acelerada y revirtió están vinculados a los niveles modificados de recursos metabólicos, alteraciones en la abundancia de proteínas y la función inmune. La vitelogenina, una proteína de la yema con funciones adaptadas en el control hormonal y de defensa celular, puede servir como un elemento regulador importante en una red que controla las diferentes dinámicas de envejecimiento de los trabajadores.

A continuación se describe la forma en la aparición de las enfermeras y los cazadores-recolectores se puede controlar, y manipulado, incluyendo la reversión de cazadores-recolectores normalmente de corta duración en las enfermeras de vida más larga. Nuestros resultados representativos muestran cómo los individuos con edad cronológica similares diferencian en cazadores-recolectores y las abejas nodrizas, en condiciones experimentales. Ejemplificamos cómo reversión del comportamiento de los cazadores-recolectores de nuevo a las enfermeras puede ser validado. Última, mostramos cómo los diferentes senescencia celular se puede evaluar mediante la medición de la acumulación de lipofuscina, un biomarcador universal de la senescencia.

Para el estudio de los mecanismos que pueden vincular las influencias sociales y el envejecimiento de la plasticidad, este protocolo constituye un instrumento estandarizado establecido para adquirir material de la muestra correspondiente, y para mejorar la comparabilidad de los datos entre los estudios futuros.

Introduction

Las complejas estructuras de colonias de animales altamente sociales se mantienen a través de la interacción de una casta reproductiva, y una casta de ayudante normalmente los trabajadores no se reproduzcan con las diferentes conductas de tarea social. En los diferentes trabajadores, las adaptaciones fisiológicas específicas permiten a los comportamientos de cuidado sib distintas, y también están vinculados a las diferencias de vida útil extremas. Las abejas y las ratas topo representan los modelos animales más desarrollados para estudiar cómo la sociabilidad está vinculada a patrones de aceleración, insignificante o invertido envejecimiento ^1-3.

En las colonias de abejas de miel, una sola reina que pone huevos con la asistencia de miles de trabajadores que tienden a las crías, buscar comida, y participar en la vigilancia, la termorregulación o comportamientos de higiene ^4. Entre estos trabajadores son los recolectores extremadamente efímeras, las abejas nodrizas con intermedio, y el invierno (diutinus) esperanzas de vida más largas con las abejas. Los individuos, sin embargo, no están obligados permanentemente a cierto wotipo rker, pero mostrar una ontogenia conductual flexibles: se cambian de un comportamiento tarea social a otro ("castas temporales"). Abejas Callow pueden cambiar a la cría tendiendo las abejas nodrizas, que con el tiempo puede cambiar al forrajeo exterior. Sin embargo, las abejas nido inexperto también pueden transformarse en las abejas más longevos de invierno, y recolectores de corta duración, incluso puede volver a enfermeras típicamente de vida más larga. Trabajadores con extrema (las abejas de invierno) e intermedio (abejas nodrizas) vida han bien desarrollado de producción y almacenamiento de alimentos órganos con cuantiosos recursos - a diferencia de cazadores-recolectores de corta duración (revisado en ^1,5). Sin embargo, que la regulación de la vida útil individuo va más allá de simples cambios en el equilibrio de los recursos de un individuo es sugerido por la investigación sobre una proteína de la yema, que tiene diversas funciones adaptadas en el trabajador de castas no reproducir, como la producción de jalea de ^6, control hormonal ^7, inmune ⁸ y anti-oxidante defensa ^9.

Los patrones de fdisminución unctional (senescencia) disparidades espejo de vida útil entre los trabajadores, según lo establecido para olfativo, y también para otras funciones cerebrales o motoras ^10-13. Específicamente, la disminución significativa en la función de aprendizaje después de sólo dos semanas de forrajeo coincide con una progresión similar en la mortalidad de forraje ^14, en oposición a la falta de disminución detectable (senescencia insignificante) en de larga vida abejas de invierno ^15.

Para identificar las huellas dactilares moleculares del envejecimiento flexibles adaptamos paradigmas experimentales establecidos que permitan el seguimiento y la manipulación de las transiciones de tipo de envejecimiento ^8,16,17. Experimento 1 se detalla cómo obtener muestras en las que los efectos de la edad cronológica y de tipo trabajador conductas sociales específicas sobre el envejecimiento pueden separarse. Experimento 2 se describe la inversión de cazadores-recolectores con acelerados en las abejas nodrizas con dinámica de envejecimiento más lento. Experimento 3 se presenta un enfoque para probar los efectos de la senescencia celular por anatomical cuantificación de un biomarcador establecido para el envejecimiento celular (lipofuscina) ^18.

Protocol

1. Desacoplamiento senescencia de Edad cronológica

En esta sección se describe la configuración de las colonias dobles de cohortes, que consisten en una cohorte de individuos identificados que comparten la misma edad cronológica ("grupo de edad único") y una cohorte de abejas nido. Los mismos individuos de edad de la cohorte de edad solo el tiempo se separan en diferentes tipos de trabajadores-con diferentes dinámicas de envejecimiento - estas son las abejas nodrizas con abejas desacelerado y cosechadoras de forraje con el declive funcional acelerada. Todos los procedimientos se describen, por una colonia experimental. Asesoramos, sin embargo, para realizar experimentos durante al menos dos réplicas de colonias para que los efectos de colonias pueden ser controlados para (dos replicados-diseño).

1. Preparación de las cajas de colmena para las colonias dobles cohorte: Prepare una caja regular colmena que recibe dos peines de alimentos con miel, otro peine de alimentos con el polen, y dos panales vacíos. Asegúrese de colocar una reina acoplado, así como una colonia de donantes con más de 3.000abejas nido. Ambos se introducirán más tarde (1.3).
2. Obtención y marcado individuos con edad cronológica similar: Recoger peines con cría sellada que está a punto de emerger. Para un replicado esperar para recoger peines con un total de 3.000-5.000 celdas de cría tapados. Para cada réplica utilizar una cantidad equilibrada de cría de al menos tres fuentes diferentes de la colmena para evitar distribuciones asimétricas de genotipos maternos (origen colmena).
   1. Coloque panales de cría en una incubadora a 34 ° C con una humedad relativa de 60-70%. Asegúrese de guardar los peines de tal manera que la colonia emergente no puede escapar.
   2. Deje que las abejas emergen durante dos días y marcan estas abejas con una pequeña etiqueta de la pintura en el tórax (por ejemplo Uni POSCA, Mitsubishi Pencil Co. Ltd.). La marca de pintura permitirá la identificación de las abejas de la cohorte de edad solo (día de la emergencia), y para distinguirlos de otras colonias replicadas.
3. Configuración de una colonia cohorte doble, que incluye la cohorte de identified, abejas sola edad: En el día de las abejas jóvenes han sido marcados, recogen unos 2.500-3.000 abejas nido de una colonia de donantes (compare la sección 1 en la discusión.), y agregar estas abejas sin marcar a la caja de la colmena que fue preparado antes (ver paso 1.1). Estas últimas personas constituirán la cohorte de nido de abeja no identificado.
   1. Añadir a la reina, que se limitaba inicialmente a una jaula de la reina (disponible en el comercio). Selle la caja con dulces comestibles (por ejemplo Apifonda, Südzucker AG, Mannheim / Ochsenfurt, Alemania) para que las abejas obreras liberan lentamente la reina.
   2. Añadir las abejas recién nacidas y marcados, los cuales constituirán el grupo de edad único. Estas abejas son los individuos sólo marcados, y son el grupo de enfoque para todos los pasos siguientes.
4. Monitoreo de forrajeo inicio y marcado recolectoras: Evaluar la aparición y la dinámica de la transición enfermera-recolector en el grupo de edad única, supervisará la evolución demográfica de la actividad de forrajeo de correomuy otro día para cada colonia. Empiece a contar cinco días después de colonias se establecieron (Figura 1).
   1. Cuente el número total de las abejas regresan de forrajeo vuelos (recuentos de entrada) a menos de 3 x 20 min períodos de observación a horas fijas. Asegúrese de no contar con las abejas durante los períodos de vuelos de orientación (ver Discusión).
   2. Cuando los conteos de entrada indican una considerable actividad de forrajeo de comenzar (> 100 cuentas de ingreso / día), comience marcando recolectoras. Para ello, Cosechadoras de forraje de la cohorte de edad única (individuos marcados individuales) reciben una segunda marca de pintura al regresar de sus primeros vuelos de forrajeo. Esta marca de pintura especificará el día de inicio de forrajeo, y permitirá identificar más tarde de la edad de forrajeo para cada recolector.
   3. Repita marcas diarias hasta que un número suficiente de abejas ha sido marcado. Para la estimación de un número suficiente de forraje marcados, esperar una tasa de recuperación de no más de 5-10% después de estas abejas habían sido envejecido, típicamente después de 14 días deforrajeo.
5. Muestreo: Desde todas las abejas marcadas inicialmente tienen una edad cronológica semejante, los grupos de la misma edad de las enfermeras y los recolectores de edad pueden ser recogidos de forma simultánea, cuando recolectores han alimentaban durante ≥ 14 días.
   1. Soltero abejas nodrizas marcadas se recogen dentro de la colmena, y se identifican por el comportamiento de enfermería (alimentación y limpieza de las larvas con las cabezas puestas en celdas de cría abiertos).
   2. Recolectores dobles marcados también se recogen dentro de la colmena antes de que comience la actividad diaria de forrajeo.
   3. Recoger las abejas en las jaulas (tubos, cajas) que proporcionan una ventilación suficiente, y mantener a oscuras hasta su posterior procesamiento. Alternativamente, para transcriptómica, epigenética o estudios proteómicos, snap directamente abejas congelación en nitrógeno líquido. Reunir un número equilibrado de personas de todos los grupos de prueba y replicar colonias.

2. Reversión de los trabajadores con rápido a los trabajadores con el envejecimiento frenado por los cambios demográficos de la Colmena </ P>

En esta sección se detalla cómo se lleva a cabo la reversión de los trabajadores con el envejecimiento acelerado (recolectores) a los trabajadores con el envejecimiento lento (abejas nodrizas). La reversión del comportamiento es inducida, cuando recolectores experimentan una falta de las abejas nodrizas, que normalmente se dedican a cuidado de las crías. El procedimiento de reversión se separará una sola colonia se replica en dos colmenas: una colmena con la fracción de abeja enfermera ("deriva-nurse"), y otro con la fracción forrajera ("derivados de recolector"). Después de la inversión de éxito, posibles síntomas de plástico y revirtió el envejecimiento pueden ser estudiados en el grupo de edad solo con los trabajadores revertidas, continuando recolectores, que continúan las abejas nodrizas y recolectores de nueva contratación. Al igual que antes, las abejas identificados de la cohorte de edad única, no la cohorte de abejas nido no identificados, constituyen el grupo de enfoque experimental.

1. Preparación: Replicar colmenas con las enfermeras (solo marcó) y forrajeras (doble marcado) se hacen disponibles como se describe en la sección anterior. Asegúrese de no iniciar la reversión con menos de 500 recolectores marcados por colonia réplica para garantizar la recuperación suficiente después de la reversión se ha completado.
   1. Para la identificación segura de los grupos de prueba después de la inversión es crucial que toda la población forrajera en la colmena original ha sido marcado antes de la reversión. El siguiente procedimiento se describe para un replicado.
   2. El día antes de la reversión, preparar una caja colmena adicional para la colmena forager derivados (véase el paso 1.1). Localice dos reinas y dos panales de cría de las colmenas de los donantes. Antes de la transferencia a las colonias experimentales quitar todas las abejas adultas de estos peines. Una reina enjaulada (véase el paso 1.3) y un panal de cría reemplazarán queen y panales de cría en la caja original de la colmena. El otro conjunto de la reina y la cría de peine que se utilizará el día siguiente para el nuevo cuadro de colmena. Asignación similar de nuevas panales de cría y las reinas exóticas para ambos, el original y se aconseja la nueva colmena para asegurarse de que cazadores-recolectores separados y enfermeras será igualmente experiencia cambiado las señales de las colmenas ("olor de la colmena").
2. Reversión: Por la mañana, justo antes de la reversión, agregue la reina enjaulada y el panal de cría para la nueva caja que recibirá la fracción forrajera derivada. Espere hasta que comience la temporada alta de forrajeo. A continuación, mueva la colonia original con recolectores marcados y las abejas nodrizas al menos 100 m de distancia de la ubicación original.
   1. En la ubicación original, configurar el nuevo cuadro de la colmena forager derivados con la cría y única reina.
   2. Foragers dejarán el cuadro de colmena original, dislocado, y regresar a la posición original. Permitir recolectoras para volver a la posición original durante 2 horas con el fin de lograr junto a la separación completa de la población recolectora de abejas nido.
   3. Entonces, para terminar la separación, cerrar el Original "derivada enfermera" colmena, y transferirlo a un colmenar, al menos, a 3 km.
3. Mantenimiento de la colmena y la supervisión de la tarea social exitosareversión: Compruebe las colmenas experimentales regularmente, cría abierta saludable.
   1. Durante los primeros días después de la manipulación colonia reemplazar cría desatendido y muerto para reducir el potencial de carga de patógenos.
   2. Para validar reversión exitosa dentro de la colmena forager derivados, tomar fotos de panales de cría antes de la introducción de estos, y de nuevo cuando peines sean sustituidos o cuando el experimento reversión se completa (Figura 2). Las áreas con cría previamente destapado y con abierta, cría en vivo son marcadores confiables de la actividad de enfermería en las colonias de cosechadoras de forraje derivado.
4. Muestreo: Efectos fisiológicos que acompañan a la inversión social, se pueden detectar 3-8 días después de cazadores-recolectores y las enfermeras se separaron.
   1. Aconsejamos a todos los grupos de pruebas de muestreo, es decir, los trabajadores revertidas y recolectores continuadas (colmena forager derivados), así como los continuos enfermeras y recolectores recién contratados (colmena enfermera derivados) 8 días después se inicia la reversión.
   2. Columnamuestras lect como se describe en el paso 1.5.

3. Análisis de tipo Trabajador Patrones senescencia celular específica por Cuantificación de lipofuscina

La lipofuscina es un biomarcador universal de la senescencia celular. Como un producto de la acumulación intrínseca, autofluorescencia específica de lipofuscina (emisión _máx = 530 a 650 nm) se puede utilizar para la detección de ^18.

1. La disección y fijación: las abejas se enfría en hielo hasta inmóvil; retirar y diseccionar a cabo la muestra de tejido deseado.
   1. Transferencia en fijador (4% de paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato, PBS, pH 7,2) para la incubación durante la noche a 4 ° C.
   2. Lávese las muestras 3 veces en PBS.
2. Procesamiento de tejidos y de montaje: Cortar muestras de tejido en secciones con no más de 40 m de espesor, por ejemplo mediante el uso de un micrótomo cuchilla vibrante, por ejemplo, de Leica VT 1000S (Leica Biosystems, Nussloch, Alemania).
   1. Montar secciones sobre portaobjetos de microscopio en 50% de glicerol (PBS). Para sellador para almacenamiento a largo plazo cubreobjetos con esmalte de uñas.
3. La adquisición de imágenes: Detectar lipofuscina, le sugerimos utilizar un microscopio confocal de barrido láser que proporciona líneas de láser con λ = 514, 561nm o similar para la excitación, y con el ancho de banda del detector pusimos a 570-650 nm.
   1. Para una mejor identificación de lipofuscina, incluir un segundo canal, y hacer una exploración simultánea en los espectros de longitud de onda más corta (excitación = 405 nm; emisión = 410 a 450 nm). El canal de longitud de onda más larga revelará tanto, lipofuscina granular, sino también "de fondo" no específica debido a la tráquea autofluorescent y otras estructuras no granulares. El segundo canal de longitud de onda más corta solamente revelará autofluorescencia inespecíficos, pero no lipofuscina. Así, la identificación de lipofuscina puede ser faci tated mediante la comparación de las señales en ambos canales, con sólo uno de ellos revelando los gránulos con lipofuscina fluorescencia específica.
   2. Para la adquisición de imágenes de alta resolución utiliza un objetivo con un aumento de 40X o superior, y preferiblemente una apertura numérica de 1,25 o superior. Imagen Scan apila con dimensiones de aproximadamente 100 x 100 x 10 m ^3. Cada muestra individual y el tejido tiene que ser representado por varias pilas de imágenes.
   3. Para reducir la variación intraindividual e interindividual causado por la variación técnica, mantener siempre la potencia del láser y de la sensibilidad del detector constante.
   4. Para reducir el sesgo por el día a día las variaciones técnicas escanear igual número de muestras de todos los grupos de prueba en cada una de las varias sesiones de exploración.
4. Procesamiento de imágenes: Utilice los paquetes de software con módulos que permiten el procesamiento avanzado de pilas de imágenes microscópicas, por ejemplo ImageJ (Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, Maryland, EE.UU. Estados Unidos,gej.nih.gov / ij / "target =" _blank "> http://imagej.nih.gov/ij/).
   1. Generar una máxima proyección 2D para cada una de las pilas de imágenes en 3D.
   2. Aplicar un filtro de Gauss con un tamaño modesto núcleo para atenuar el ruido de alta frecuencia, y para preservar las estructuras con dimensiones de los gránulos de lipofuscina.
   3. Combinar los dos canales de color para facilitar la identificación de lipofuscina (véase el paso 3.2).
5. Analiza Imagen: Asegúrese de que el tema de realizar los pasos de cuantificación será ciego para probar la identidad de grupo.
   1. Para todas las imágenes, haga clic a la región de interés (ROI) que cubre las estructuras pertinentes, y tiene unas dimensiones similares a las del rendimiento de la inversión a partir de otras imágenes.
   2. A continuación, seleccione el número deseado de los gránulos de lipofuscina que representan cada ROI. Al seleccionar gránulos de lipofuscina dentro de un retorno de la inversión, la aplicación de las siguientes reglas reducirá el sesgo subjetivo.
      1. Elija un lugar consistente para la selección de la primera granulaciónle. Esto puede ser, por ejemplo, el borde más a la izquierda de un retorno de la inversión, y el gránulo que es más próxima al borde siempre será la primera selección.
      2. Uno tras otro, los gránulos de los escogidos que están más cerca de la selección anterior (vecino).
      3. Al elegir el vecino, moverse sólo en una dirección, por ejemplo, sólo buscar en la derecha de la selección anterior. Esta regla evita que la selección está dominado por grupos ocasionales de gránulos densos.
      4. Cuando se completa la selección, evaluar el tamaño de cada partícula lipofuscina con la descripción y la medición de la zona de gránulo respectiva. Utilice las pruebas estadísticas apropiadas para comparar individuos de los diferentes grupos de prueba.

Representative Results

Secciones 1 y 2 del Protocolo de detalle cómo los grupos de prueba se pueden obtener a estudiar los atributos de aceleración, más lentos y revierten el envejecimiento en las colonias con una sola cohorte de edad. Para controlar la diferenciación de tipo de trabajo que acompaña a la ontogenia normal, se evaluó el recuento para cosechadoras de forraje ("puntajes de ingreso") para 6 colonias (Figura 1, compare la sección 1). Los gráficos muestran que un cambio considerable de la enfermera al estado recolector no suele ser observado antes de los individuos son más de 10 días de edad. Marcada variabilidad en los recuentos de cosechadoras de forraje se observó en relación con el momento de la aparición de forrajeo entre diferentes colonias, y como una variación marcada en el día a día dentro de cada colonia. Aparte de los factores demográficos específicos de colonias, como la diferente carga de cría, tanto la variabilidad se explica por las condiciones meteorológicas (puntos de tiempo marcados en rojo en la Figura 1) cambiando. Cerrar monitoreo de la dinámica de forrajeo, por tanto, se aconseja optimizar el marcado y recogida de los esfuerzos duranteción del experimento.

La ontogenia inversa (sección 2) del forraje de nuevo a las tareas de enfermería puede ser validado mediante la inspección de panales de cría que se introducen en las colonias para cosechadoras de forraje derivado (consulte los pasos 2.2 y 2.3). Durante tres repeticiones figuras 2A, C, y E peines programa de cría antes de su introducción en colonias para cosechadoras de forraje derivado. Figuras 2B, D y F muestran los respectivos peines después de la eliminación. Parches de crías recién coronado, larvas sanas, y un mayor almacenamiento de polen alrededor de las celdas de cría indican que los antiguos cazadores-recolectores ahora se habían realizado con éxito el nido típico, incluidas las tareas de enfermería.

La lipofuscina (sección 3) es un síntoma altamente conservada de la senescencia celular, y se puede evaluar fácilmente para los análisis post-experimentales en los diversos tejidos de abejas. Figura 3 contrasta la acumulación de lipofuscina, medida como tamaño de los gránulos (Figura 3E), en las glándulas de la hipofaringe emparejados por edad enfermera unaabejas picadoras nd. La diferencia en la edad cronológica entre los dos jóvenes y los dos grupos de edad era ≥ 17 días, con un solo grupo (recolectores) de pasar estos ≥ 17 días con las actividades de vuelo y recogida de alimentos del exterior. Imágenes microscópicas Representante (figuras 3A-D) muestran aumento de la acumulación de lipofuscina sólo para el grupo de recolectores de mayor edad después de más de 17 días de búsqueda de alimento (Figura 3D), no para mayores abejas nodrizas de la edad cronológica similar (37 a 43 días; Figura 3B) . Un ANOVA de dos factorial con los factores principales de tipo trabajador fijo (forraje, enfermeras) y la diferencia de edad (Δage ≥ 17 días) reveló efectos significativos para el tipo de trabajo, la diferencia de edad y la interacción entre ambos factores _(tipo F = 33.67, P <0,001, F = _Δage 21.93, P <0.001; _tipo F _{x Δage} = 22.07, P <0,001). Sin embargo, las pruebas post-hoc sólo mostraron efectos significativosal contrastar recolectores de edad avanzada (≥ 17 días de búsqueda de alimento) para cosechadoras de forraje más pequeños, o para ambos grupos de enfermería (PF 17d vs F _1d/N1d/N17d <0,001, LSD de Fisher; Figura 3E). No se detectaron diferencias entre los tres últimos grupos, incluidos los grupos cronológicamente jóvenes y viejas enfermeras (todas las pruebas con P> 0,5, LSD de Fisher; Figura 3E). Esto sugiere que la acumulación de lipofuscina depende de actividades específicas para cosechadoras de forraje (forrajeo edad), en lugar de ser función de la edad cronológica por sí sólo.

Figura 1. De tipo Trabajador diferenciación durante la ontogenia normal. Los recuentos gráfico muestra la entrada de cazadores-recolectores que regresaban de vuelos de forrajeo contado para 6 colonias diferentes a partir de 5 días después de haber estado establecidas (para detalles compara sección Protocolo 1.4). Transición considerable de neer a actividades de forrajeo fue observado por primera vez cuando los individuos marcados de la cohorte de edad solo fueron unos 10 días de edad. Pendientes que varían de los condes de ingreso acumulados indican que la dinámica de la abeja enfermera a la transición forager difieren entre las colonias, y se ven afectados por factores climáticos. Por ejemplo, en días con lluvia y menos de dos horas de búsqueda de alimento, el aumento en el recuento de entrada típicamente aplanado (puntos de datos en rojo).

Figura 2. Validación de la reversión del comportamiento. Para probar si recolectoras han vuelto con éxito a las tareas de enfermería, se compararon los panales de cría antes de que se introdujeron en las colmenas para cosechadoras de forraje derivado, y después de que fueron retirados de estas colmenas. Imágenes representativas muestran panales de cría antes de la introducción (A, C, E) ydespués de la eliminación (B, D, F) de tres colmenas para cosechadoras de forraje derivado diferentes, respectivamente. Cuidado de las crías de las abejas forrajeras anteriores se indica con un número creciente de células con cría de obreras (B, D, F, flecha negro, el recuadro en la D), sostenida supervivencia de las larvas de celdas abiertas (flecha roja) y el aumento de almacenamiento de polen de cerca celdas de cría (flecha blanca). Tenga en cuenta que para cosechadoras de forraje derivado de colonias inicialmente suelen ser menos eficientes en el cuidado de la cría de colonias de enfermería derivado. Esto puede conducir a una mayor mortalidad de las larvas en las cosechadoras de forraje-colonias derivadas. Imágenes en B, D, F se tomaron 5, 4 y 7 días después de panales de cría fueron introducidos en las colonias para cosechadoras de forraje derivado.

Figura 3. La acumulación de lipofuscina, un biomarcador de la célulasenescencia ular, puede indicar tipo trabajador el deterioro del tejido específico. Representante imágenes microscópicas de las glándulas de la hipofaringe en jóvenes (A) y las abejas nodrizas de edad (B), así como en las abejas para cosechadoras de forraje de la misma edad ≥ 1 día (C), respectivamente ≥ experiencia de 17 días de forrajeo (barra de escala en A = 20 micras). La acumulación de lipofuscina se midió como el tamaño del gránulo, y se le da como mediana y cuartiles para N = 5 personas de cada edad y tipo de trabajador (E). Forrajeo durante 17 días dio lugar a la acumulación de lipofuscina significativo, mientras que el mismo período no se tradujo en cambios de lipofuscina en las abejas nodrizas (para ver las estadísticas de los resultados).

Discussion

Estamos aquí adoptamos anteriormente descrito se acerca ^{8,16,17,19,20,} e integrarlos en un único flujo de trabajo que facilitará el estudio del envejecimiento flexibles en las abejas de miel. Nuestro objetivo es proporcionar a los científicos que son novatos en este campo con una herramienta estandarizada establecido para obtener material de la muestra correspondiente, y para mejorar la reproducibilidad experimental entre los diferentes equipos de investigación. Mientras que nuestros procedimientos se simplifican y no requieren equipo especial, como en las descripciones anteriores (comparar, por ejemplo, ^8), se aconseja algunas medidas de precaución y se recogen a continuación.

Disociar la senescencia de la edad cronológica. Un aspecto más crítico es evitar la falsa identificación de las abejas forrajeras durante la confirmación inicial de los comportamientos de forrajeo (marcado 2 ^ª). Por lo tanto, cuando recolectores deben ser monitoreados ("cuenta de entrada") o marcado, no estrictamente evitar períodos diarios con vuelos de orientación. Durante estos períodos muchos pre-forosabejas etapa ging partirán o introduzca la colmena. Estas abejas no muestran características fisiológicas típicas de cazadores-recolectores maduros, pero acumulan un mapa espacial de los alrededores de la colmena por los patrones de vuelo circular fácilmente identificables ^21.

Aunque la mayoría de las abejas cambian para forraje con la edad de 2 semanas o más, forrajeo esporádica se observa ya a edades muy tempranas (Figura 1). Recolectores Extremadamente precoces suelen desarrollar directamente de las abejas nido inexpertos sin haber pasado por la etapa de la enfermera. Para no incluir a personas con una ontogenia tal aberrante (compárese ²² y sus referencias), los individuos que comienzan alimentándose con la edad de 10 días o menos no se consideran para otros análisis.

Para evitar una mayor representación excesiva de cazadores-recolectores precoces, no hacemos uso de los clásicos "colonias individuales de cohorte", que consisten sólo de la única cohorte de edad ^17,23. En cambio, cuando la creación decolonias que añadimos abejas nido aleatoria ("cohorte abeja nido") a la cohorte de edad único marcado (ver pasos 1.1 y 1.3). Desde abejas nido aleatorios son generalmente mayores, que pueden reducir la presión sobre las abejas más jóvenes a convertirse en cazadores-recolectores extremadamente precoces ^17. Tales colonias dobles cohorte, por lo tanto, mejor pueden parecerse a una demografía colmena natural con las personas que progresan lentamente de enfermería para forraje.

Cuando adaptaciones específicas de los trabajadores a largo plazo deben ser estudiadas, recoger todos los grupos de prueba fuera de forrajeo horas. Esto se recomienda para reducir el sesgo de ajustes metabólicos más agudos debido a la actividad locomotriz de los últimos, por ejemplo, el agotamiento de vuelo.

Reversión de los trabajadores con un rápido a más lento el envejecimiento cambiando la demografía de la colmena. Después de cazadores-recolectores habían volado de vuelta a la ubicación original es esencial para alejarse de la colmena enfermera derivados (> 3 km). Esto es para evitar que las abejas de la etapa pre-forrajeo son reclutados y guiados a laantigua ubicación por otras abejas, respectivamente, a través de comunicación de feromonas ^24.

Para evitar aún más cualquier enfermera o otros individuos pre-búsqueda de alimento entre en la colmena forager derivados, aconsejamos acuerdo con las siguientes reglas: (i) poner fin al procedimiento de separación antes del inicio de los vuelos diarios de orientación. (II) Sólo intentar la reversión en los días en que se observa una fuerte actividad de forrajeo. (III) Durante y después de la translocación inicial de la colmena original, evitar la agitación innecesaria de las abejas, en particular, no abra la colmena.

En principio, las configuraciones más artificiales que limitan recolectores en un ambiente enfermera privados también pueden dar lugar a la reversión. Sin embargo, estas configuraciones sólo valor informativo han limitado como las cosechadoras de forraje derivado de la fracción experiencias de otros entornos estresantes, lo que impide una comparación directa con los grupos de control de colonias de enfermería derivado.

Confirmación de diferentes patrones de senescenciamediante la cuantificación de lipofuscina, un biomarcador de la senescencia celular. Aquí nos ejemplifica evaluación lipofuscina con imágenes y datos estadísticos de las glándulas hipofaringe porque lipofuscina es más fácilmente detectable en este tejido. Esto, creemos, es importante ayudar a la creación de los protocolos correctos para la detección microscópica observador inexperto. Sin embargo, a diferencia de otros tejidos, glándulas hipofaringe no muestran apoptosis y necrosis significativa durante enfermera para cosechadoras de forraje transición ^25. Tales procesos pueden interactuar con la acumulación del marcador de senescencia, aunque no detectamos aumento de los niveles de lipofuscina en forrajeras jóvenes que recientemente habían cambiado de tareas de enfermería (Figuras 3C, E). Sin embargo, para evaluar las medidas de senescencia en otros tejidos de abejas, los métodos basados ​​en la microscopía descritos aquí pueden adaptarse fácilmente.

Alternativamente, los enfoques de flujo de citometría son menos tiempo ^26. Análisis basados ​​Microscopía-tienen la ventaja de que los síntomas del envejecimiento celular pueden ser evaluados para diferentes regiones o incluso de células dentro de una sola órganos ^27. Para los estudios en el cerebro y otros órganos complejos con la heterogeneidad espacial en el envejecimiento celular ^28, por lo tanto recomendamos el enfoque basado en la microscopía.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Apifonda	Südzucker AG, Mannheim/Ochsenfurt, Germany
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	P4417
Glycerol	Merck	1.04094.1000