재조합 단백질의 미끼를 사용 파지 디스플레이와 궁합 선택을위한 프로토콜
Summary
파지 디스플레이는 그 고정 된 분자와 상호 작용하는 단백질이나 단백질 부분을 캡처 할 수있는 강력한 기술이다. 생성하는 파아지 cDNA 라이브러리의 형식과 스크린의 결정이 제작되면, 여기에 설명 된 프로토콜 인터랙의 식별에 이르는 효율 선호도 선택을 허용한다.
Abstract
고정 미끼 분자 방향성 복제 cDNA 라이브러리로 인코딩 된 다양한 단백질 부분을 제시 할 수있는 발판 재조합 파지를 사용하여 상호 작용을 발견 할 수있는 효율적인 수단입니다. 기술은 주로 단백질 – 단백질 상호 작용을 발견하기 위해 사용되었지만 도전을 미끼 분자는 단백질에 한정 될 필요는 없다. 여기에 제시된 프로토콜은 미끼의 소극적인 수가 동일한 단백질을 제시하는 독립 클론의 식별을 최대화하기 위해 반복 실험으로 스크리닝 할 수 있도록 최적화되었다. 이 확인 된 상호 작용하는 단백질이 미끼 분자의 합법적 인 인터랙 것을 더 큰 자신감을 허용합니다. 각각의 선호도 선택 후 파지 역가를 모니터링 라운드 선호도 선택이 음성 대조군의 효과뿐 아니라 어떻게 진행되고 있는지에 대한 정보를 제공합니다. 하나는 파지를 titering, 방법을 통해 어떤이 과정이 효율적으로 진행 할 수 있도록 사전에 준비수는 표시됩니다. 독립적 인 플라크의 격리 다음 검색 증폭 산물의 특성이 선호도 선택은 진행 상황을 잘 확인하는 데 사용할 수있는 강조 표시됩니다. 문제가 잘못된 반응을 최소화하기 위해 또는 지속적으로 파지를 복구 우회하는 기술 촬영이 설명되어 있습니다. 바이러스 오염 플레어 업을 줄이는 수단이 논의된다.
Introduction
왜 대신에 다른 분자와 단백질의 상호 작용을 발견하고 조사에 사용할 수있는 수많은 다른 기술의 파지 디스플레이와 궁합 선택을 사용할 수 있습니까? 파지 디스플레이는 다음과 같은 단백질 – 리간드 상호 작용 1-3을 검출하는 다른 방법을 통해 몇 가지 독특한 장점을 청구 할 수 있습니다 :
미끼 분자의 매우 넓은 레퍼토리
가장 중요한 이유는 친화력 선택 4 미끼 역할을 할 수있는 분자의 다양성에있다. 파지 디스플레이는 고분자 / 분자가 복구 지원에 부착 할 수있는 경우 기본적으로, 그것은 파지 표시 단백질과 선호도에 대한 검사를 할 수있는 다른 단백질, 핵산, 탄수화물 등 5과 상호 작용하는 단백질 조각을 분리하는 매우 강력한 수단이다. 조건은 연구에 사용하는 경우 또한, 미끼 분자는 6 고정 때 생물학적 활성을 유지하는지 확인하기 위해 액세스 할 수 있습니다활동을 제거 / 끌어 내다 전에 친 화성 선택에 미끼로 번역 후 변형을 소개하고, 6 효과 또는이다.
외부 요인에 파지 저항
파지 디스플레이를 사용하는 두 번째 이유는, 그것이 어떤 미끼가 상호 작용하는 단백질을 캡처하는 환경 스트레스 (열, 높은 osmolyte 농도, 특정 보조 인자, 등.)을 요구할 수 있다는 가능하다는 것을, 또는 파지 디스플레이 단백질 든 변경해야 할 수도 친화력 선택하기 전에. 연구되고있는 요인은 먹이와 단백질 아니라 그것이 시험 유기체에 치명적인 경우 상호 작용이 발생할 수있게하거나 상태 사이의 상호 작용이다. 그것은 (T7 생존을위한 출판 열 최대 ~ 60 ° C 7입니다 예) 그대로 실행 가능한 두 가혹한 실험 조건을 견딜 수 있기 때문에 T7 파지는 이러한 연구에 특히 적합합니다. 바꾸는 파지의 예는 프로 표시로수리 효소의 단백질 기질의 애기 장대 종자 프로테옴을 검사 할 때 teins는 단백질 Isoaspartyl 메틸 Transferease (PIMT)는이 연구에 사용 된 바이러스는 도입을 장려하기 위해, 이전에 각 친화력 선택에 라운드, 일주일 동안 "세"있었다 isoaspartate의 (isoAsp는) 인식 및 수리 / 등의 이상을 대사 할 수 유기체에서 할 수없는 민감한 단백질 6 잔류 물.
대사 적 불활성
또한, 파지는 일반적으로 신진 대사 독과, 적어도, 대사 활성 시험 생물에다면 발현 성 효과가 발생할 것 작은 분자 간섭에 저항. 엄격 세척 후, 독은 독성이 세균 또는 후속 파아지 복제 무해한 범위로 희석되도록 박테리아의 대량 감염이 도입되기 전에 제거된다. PIMT 수리 단백질 표적을 조사하는 동안효소, S-아데노 메티오닌 (AdoMet)는 효소를 불 활성화하고 유용한 음성 대조군이있는 보안 제공하기 위해 S-아데노 호모시스테인 (AdoHcy)에 의존하면서 표적 단백질 캡처를 허용하도록 마이크로 타이 터 플레이트 잘 고정화 효소를 활성화하는 데 사용되었다 바이러스에 악영향 AdoMet 또는 AdoHcy 6도에 의해 영향을받을 수없는 것이 지식. 또한이 실험실에서 조사 특정 늦은 배아 풍부한 (LEA) 단백질 가족의 일원은, 시점에 콩 씨앗에서 200 밀리미터의 높은 농도를 달성 할 수 자당 8 등의 첨가제의 존재에 자신의 형상을 변경하는 것으로 알려져있다 생리적 성숙 9. 바이러스는 자율적으로 실행 가능한 시험 생물 (10)의 경우에는 해당되지 않습니다 특정 LEA-클라이언트 단백질 상호 작용에 대한 가능성에 필요한 각각의 친화력 선택 라운드, 200 MM의 자당의 첨가에 의해 영향을받을 것으로 예상되지 않습니다.
이 연구소는 discoverin에 초점을 맞추고있다G 단백질 – 단백질 탈수 (11) 또는 씨가 6 흡수 된 후에 isoAsp 형성에 취약 저장 프로테옴의 구성 요소를 복구하는 동안 저장 프로테옴 보호의 메커니즘을 기초 성숙, 탈수 또는 발아 씨앗의 상호 작용. 따라서, 생산 및 정제 활성 상태에 미끼로 필요한 재조합 단백질, 그들이 고정화 전후에 자주 어려운, 우리의 작업에 기초하지만 그들은, 그래서 남아 보장한다. 각각의 재조합 단백질 생산 시나리오가 다르기 그러나, 재조합 단백질 생산을위한 최적화 조건은 여기서 언급되지 않을 것이다. 사용자는 (이 효소 경우 마이크로 플레이트의 우물에서 효소 분석을, 예를 들면) 고정 된 단백질이 여전히 작동하는지 확인하기 위해, 가능한 한, 시도 촉구된다. 이것은 어떤 발견 상호 작용이 있는지, 미끼 따라서 생물학적 활성과 자신감을 제공합니다생물학적 관련성이 다소 가능성.
Protocol
Representative Results
Discussion
세 복제 웰 실험을 실행하여, 미끼에 결합하는 동일한 단백질의 독립적 취득한 파지들은 동일한 클론 획득 된 CDS 영역의 뉴클레오티드 서열 (즉, 명 차이지만 이러한되었을 경우에도 구별 될 수있다 ) 독립 우물에서 검색. 그렇지 않으면, 미끼에 결합하는 단백질을 코딩 동일한 파지를 구별하기위한 유일한 방법은 그들이 독립적 뉴클레오티드 서열의 일부가 다를 전사 영역을 반대로하는 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
해치, McIntire – 스테니스 (AD421 CRIS), USDA 씨 그랜트 (2011-04375), 및 ABD에 선생님 프레드릭 맥 매스터 연구 활동,이 프로젝트는 부분적으로 NSF IOS (0849230)에 의해 투자되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
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