Un Protocolo de fagos y de selección de afinidad utilizando cebos proteína recombinante
Summary
La presentación en fagos es una técnica poderosa para capturar las proteínas o restos de proteínas que interactúan con una molécula inmovilizada de interés. Una vez que se ha tomado una decisión del tipo de fago biblioteca de cDNA para crear y pantalla, el protocolo aquí descrito permite la selección por afinidad eficaz que conduce a la identificación de los interactores.
Abstract
Uso de fago recombinante como un andamio para presentar diversas porciones de proteínas codificadas por una biblioteca de ADNc clonado direccionalmente a las moléculas inmovilizadas de cebo es un medio eficaz para descubrir las interacciones. La técnica ha sido ampliamente utilizado para descubrir las interacciones proteína-proteína, pero la molécula cebo a ser cuestionada no tiene que ser restringida a las proteínas. El protocolo que aquí se presenta ha sido optimizado para permitir un modesto número de cebos que se proyectarán en réplicas de maximizar la identificación de clones independientes que presentan la misma proteína. Esto permite una mayor confianza en que interactúan las proteínas identificadas son interactores legítimos de la molécula de cebo. Control de la titulación del fago después de cada ronda de selección por afinidad proporciona información sobre cómo la selección por afinidad está progresando, así como sobre la eficacia de los controles negativos. Un medio de titulación de los fagos, y cómo y qué preparar con antelación para permitir que este proceso progrese lo más eficientementeposible, se presenta. Atributos de amplicones obtenidos después del aislamiento de la placa independiente se destacan que se puede utilizar para determinar lo bien que la selección por afinidad ha progresado. Se explican las técnicas de solución de problemas para minimizar los falsos positivos o de eludir persistentemente recuperó fago. Los medios para reducir la contaminación viral brote se discuten.
Introduction
¿Por qué utilizar la presentación en fagos y selección por afinidad en vez de las otras técnicas disponibles para miles de descubrir e investigar las interacciones de proteínas con otras moléculas? La presentación en fagos puede reclamar algunas ventajas únicas sobre otros métodos de detección de interacciones proteína-ligando de 1-3, incluyendo lo siguiente:
Muy amplio repertorio de moléculas de cebo
La razón más importante es en la diversidad de moléculas capaces de actuar como cebo en la selección por afinidad 4. La presentación en fagos es un medio muy poderoso para aislar fragmentos de proteínas que interactúan con otras proteínas, nucleótidos, carbohidratos, etc 5 Esencialmente, si un polímero / molécula puede estar unido a un soporte recuperable, que puede ser examinado para afinidad con las proteínas mostradas de fagos. Además, la molécula de cebo se puede acceder para determinar si se retiene la actividad biológica cuando se inmoviliza 6, si las condiciones utilizadas para reducir / eliminar su actividad son eficaces o 6, de introducir modificaciones después de la traducción a la carnada antes de la selección por afinidad.
Resistencia a los fagos a factores externos
Una segunda razón para el uso de presentación en fagos, es que es posible que algunos cebos pueden requerir estrés ambiental (calor, altas concentraciones osmolíticas, cofactores específicos, etc.) Para capturar sus proteínas que interactúan, o las proteínas que se muestran fagos puede necesitar ser alterado de alguna manera antes de la selección por afinidad. El factor principal que se está estudiando es la interacción entre la proteína cebo y, no la condición de que permite la interacción que se produzca o si es letal para el organismo de prueba. El fago T7 está particularmente bien adaptado a este tipo de estudios, ya que puede soportar condiciones experimentales duras tanto intactas y viables (por ejemplo, el máximo térmico publicado para la viabilidad de T7 es de ~ 60 ° C 7). Como un ejemplo de fago que altera la muestra Proproteínas, al examinar el proteoma de semillas de Arabidopsis thaliana para sustratos de proteína de la enzima reparadora, Proteína Isoaspartyl metil transferasa (PIMT), el virus usado en estos estudios habían sido "abierto" durante una semana, antes de cada ronda de selección por afinidad, para fomentar la introducción de isoaspartate (isoAsp) los residuos en las proteínas susceptibles 6 que no es posible en los organismos que pueden reconocer y reparar / metabolizar tales anomalías.
Metabólicamente inerte
Además, el fago son generalmente resistentes a venenos metabólicos y interferir moléculas pequeñas que, por lo menos, dar lugar a efectos pleiotrópicos sobre los organismos de prueba metabólicamente activas. Tras los lavados de rigurosidad, el veneno se elimina antes de que un gran volumen de bacterias se introducen para la infección de modo que el veneno se diluye a una gama inocuo para las bacterias o la replicación del fago posterior. Mientras investiga dianas proteicas de la reparación PIMTenzima, S-adenosil metionina (AdoMet) se utiliza para activar la enzima de microtitulación-placa-así inmovilizado para permitir la captura de la proteína diana mientras que confían en S-adenosil homocisteína (AdoHcy) para inactivar la enzima y proporcionar un control negativo útil en asegurar el conocimiento de que el virus no se vería influenciada negativamente por cualquiera AdoMet o AdoHcy 6. Además, los miembros de ciertas familias de la embriogénesis tardía abundante de proteínas (LEA), investigados en este laboratorio, se sabe que altera su forma en presencia de aditivos tales como sacarosa 8, que pueden alcanzar concentraciones de hasta 200 mm de semillas de soja en el punto de madurez fisiológica 9. No se prevé que el virus sea influenciado por adición de sacarosa 200 mM en cada ronda de selección por afinidad, posiblemente necesario para determinadas interacciones de proteínas de LEA-cliente, que no es el caso de organismos de ensayo viables autónoma 10.
Esta práctica de laboratorio se ha centrado en DESCUBRIRg interacciones proteína-proteína en semillas maduras, deshidratados o en germinación que subyacen en el mecanismo de protección proteoma almacenado durante la deshidratación 11 o la reparación de componentes de la proteoma almacenado que son susceptibles a la formación isoAsp una vez que la semilla ha embebido 6. Por lo tanto, la producción y purificación de las proteínas recombinantes requeridos como cebo en un estado activo, y la garantía de que se mantengan así, antes y después de que se inmovilizan, aunque con frecuencia difícil, es una piedra angular de nuestro trabajo. Sin embargo, a medida que cada escenario de producción de proteínas recombinantes es diferente, las condiciones para la optimización de la producción de proteína recombinante no se abordan aquí. Se insta a los usuarios a intentar, siempre que sea posible, para determinar si la proteína inmovilizada es aún funcional (por ejemplo, si se trata de una enzima, hacer un ensayo enzimático en los pocillos de la placa de microtitulación). Esto proporciona cierta confianza en que el cebo es biológicamente activo y por lo tanto, que cualquier interacción descubiertos sonalgo más propensos a tener relevancia biológica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mediante la ejecución del experimento en tres pocillos replicados, fago adquirido de forma independiente de la misma proteína de unión al cebo puede distinguirse incluso si son del mismo clon (es decir, no hay diferencia en la secuencia de nucleótidos de la región de CDS que ha sido adquirida, pero estos han sido recuperados de pozos independientes). De lo contrario, la única manera de distinguir entre el fago que codifica la misma proteína de unión a la carnada es si son independientemente inversa regi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este proyecto fue parcialmente financiado por un IOS NSF (0849230); Hatch, McIntire-Stennis (AD421 CRIS), Fondo Semilla USDA (2011 a 04375), y Sir Frederick McMaster de Becas de Investigación de ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
Referências
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