Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки
Summary
Фаговый дисплей является мощным средством для захвата белки или белковые фрагменты, которые взаимодействуют с иммобилизованным интерес молекулы. Как только решение от типа фага библиотеки кДНК для создания и экран был сделан, протокол, описанный здесь позволяет эффективный выбор сродства, ведущие к идентификации interactors.
Abstract
Использование рекомбинантного фага в качестве каркаса, чтобы представить различные белковые части кодируемые направленно клонированных библиотеки кДНК в иммобилизованных молекул приманки является эффективным средством, чтобы обнаружить взаимодействия. Методика в основном используется, чтобы обнаружить белок-белковых взаимодействий, но молекула приманка будет вызов не должен быть ограничен белков. Протокол, представленные здесь была оптимизирована, чтобы позволить скромный количество приманок, которые будут показаны в повторах, чтобы максимизировать идентификацию независимых клонов, представляющих один и тот же белок. Это позволяет большую уверенность, что взаимодействующие белки, определенные законные interactors молекулы приманки. Мониторинг фага титр после каждого выбора аффинной круглый предоставляет информацию о том, как сродство выбора прогрессирует, а также от эффективности отрицательных контролей. Одним из средств титрование фаг, и как и к чему готовиться заранее, чтобы этот процесс прогрессировать так же эффективно, каквозможно, представлен. Атрибуты ампликонов, полученных После выделения независимого налета выделены которые могут быть использованы, чтобы установить, насколько хорошо сродство выбора прогрессировала. Устранение неисправностей методы, чтобы свести к минимуму ложные срабатывания или обойти упорно восстановлены фаг объясняются. Средства снижения вирусного заражения вспыхнуть обсуждаются.
Introduction
Зачем использовать фага дисплей и выбор сродства вместо множества других методик для выявления и расследования белковых взаимодействий с другими молекулами? Фаговый дисплей может претендовать некоторые уникальные преимущества по сравнению с другими методами обнаружения белка-лиганда взаимодействия 1-3 включая следующие:
Очень широкий репертуар молекул приманки
Всего причина в том, в разнообразии молекул, способных действовать в качестве приманки в аффинной выбора 4. Фаг дисплей является очень мощным средством выделения фрагменты белков, которые взаимодействуют с другими белками, нуклеотиды, углеводы и т.д. 5 существу, если полимер / молекула может быть присоединена к восстанавливаемой поддержки, он может быть подвергнуты скринингу на сродство фага с отображаемыми белков. Кроме того, молекула приманка может быть доступна, чтобы определить, если он сохраняет биологическую активность при иммобилизации 6, если условия используется для Rразвиваются / устранить свою деятельность эффективны 6 или, ввести пост-трансляционные модификации к приманке до аффинной селекции.
Фага сопротивление внешних факторов
Вторая причина для использования фагового дисплея, является то, что не исключено, что некоторые приманки может потребовать экологического стресса (тепла, высокие концентрации осмолита, конкретные кофакторов, и т.д..), Чтобы привлечь их взаимодействующих белков, или фаг, отображаемые белки возможно, должны быть каким-то образом изменены до аффинной селекции. Основным фактором, изучается взаимодействие между приманки и белка, а не при условии, что позволяет взаимодействие происходит или, если это смертельным для тест-организма. Фага Т7 особенно хорошо подходит для таких исследований, поскольку он может выдерживать суровые условия эксперимента и неповрежденными и жизнеспособным (например, опубликованные тепловой максимум на Т7 жизнеспособности составляет ~ 60 ° C 7). Как пример, изменяющего фага отображается пробелки, при рассмотрении арабидопсис семян протеома для белковых субстратов ремонта фермента, белка Isoaspartyl Метил Transferease (PIMT), вирус, используемый в этих исследованиях был "в возрасте" в течение одной недели, до каждого выбора аффинной круглые, способствующих внедрению из isoaspartate (isoAsp) остатки в подверженных белков 6, которые не представляется возможным в организмах, которые могут признать и ремонт / усваивают такие нарушения.
Метаболически инертным
Кроме того, фаг, как правило, устойчивы к метаболическим ядам и вмешательства малых молекул, которые бы, по крайней мере, привести к плейотропных воздействия на метаболически активных тест-организмов. После промывки жесткости, яд удаляется перед большой объем бактерий вводятся для инфекции так яд разбавляют до диапазона безвредны дл бактерий или последующей репликации фага. Расследуя белковые мишени из ремонта PIMTфермент, S-Аденозил метионин (AdoMet) был использован для активации микро-титр-пластинчатый хорошо иммобилизованного фермента, чтобы разрешить захват белка целевой опираясь на S-аденозил гомоцистеина (AdoHcy) для инактивации фермента и обеспечить полезный отрицательный контроль обеспечения в знание того, что вирус не будет оказывать неблагоприятное воздействие либо AdoMet или AdoHcy 6. Кроме того, члены определенных позднего эмбриогенеза Обильные (LEA) белковых семейств, исследованных в этой лаборатории, как известно, изменить их форму в присутствии добавок, таких как сахароза 8, которые могут достичь концентрации столь же высоко как 200 мм в семенах сои в точке физиологического погашения 9. Вирус не ожидается, будут зависеть от того 200 мМ сахарозы в каждом сродство выбора тура, возможно, необходимой для определенных белковых LEA-клиент взаимодействий, которая не относится к автономно жизнеспособных тест-организмов 10.
Эта лаборатория была сосредоточена на discoverinг белок-белковых взаимодействий в зрелых, обезвоженных или прорастающих семян, лежащих в основе механизма, хранящейся защиты протеома во время обезвоживания 11 или ремонта компонентов хранимой протеома, которые чувствительны к образованию isoAsp раз семя впитал 6. Таким образом, производство и очистка рекомбинантных белков, необходимых в качестве приманки в активном состоянии, и обеспечение того, чтобы они по-прежнему так, до и после того как они обездвижены, хотя часто трудно, является краеугольным камнем нашей работы. Однако, так как каждый рекомбинантный белок сценарий производство отличается, оптимизируя условия для рекомбинантного белка не будет рассматриваться здесь. Пользователи, настоятельно рекомендуется пытаться, насколько это возможно, чтобы определить, если иммобилизованный белок по-прежнему функционирует (например, если он является ферментом, сделать ферментного анализа в микропланшетном планшета). Это даст некоторую уверенность, что приманка биологически активными и поэтому, что любые обнаруженные взаимодействиянесколько чаще обладают биологической значимости.
Protocol
Representative Results
Discussion
При запуске эксперимента в трех реплицированных скважин, независимо приобрела фаг того же связывания с белками к приманке можно выделить даже если они одинаковы клон (т.е. нет разницы в нуклеотидной последовательности района CDS, что было приобретено, но они были извлекаются из нез?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Этот проект был частично финансируется за счет NSF IOS (0849230); Hatch, Макинтайр-Stennis (AD421 КРИС), USDA семян Грант (2011-04375), и сэр Фредерик МакМастер исследовательский грант на ABD.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Tryptone | Becton Dickinson Co. | 211705 | |
| Yeast Extract | Becton Dickinson | 212750 | |
| Agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Agarose | Research Products International | A20090 | |
| Blocking Reagent | EMD Chemicals Inc. | 69064 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | BP359-212 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-5 | |
| Chloroform | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| Escherichia coli BLT5403 | EMD Chemicals Inc. | BLT5403 | Genotype: F- ompT hsdSB (rB – mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR) |
| ampicillin, Sodium Salt | Research Products International | A40040 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP102-1 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich Corp. | A-9647 | |
| penta-HIS primary antibody | Qiagen Inc. | 34660 | |
| Goat anti mouse alkaline phosphatise conjugate | Sigma-Aldrich Corp. | A-5153 | |
| para-nitrophenylphosphate | Sigma-Aldrich Corp. | N-7653 | |
| T7-UP primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3′ | |
| T7-DOWN primer | EMD Chemicals Inc. | 5′-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3′ | |
| Qiaquick PCR Purification kit | Qiagen Inc. | 28104 | |
| Qiaquick Gel Extraction kit | Qiagen Inc. | 28706 | |
| Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit | Invitrogen Life Technologies | 4336917 | |
| Heating Block | Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.) | 18780 | |
| 96 Well Cell Culture Plates | Corning | Costar 3590 | |
| Isotemp Incubator Oven | Fisher Scientific | 516D | |
| Pasteur Pipets, 5 ¾” | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| ChromaView Transilluminator | UVP Inc. | TS-15 | |
| UV Shield | Oberon | 071AF | |
| Gloves, Nitrile | Fisher Scientific | 19-170-010C | |
| Sterile 1.5 ml tubes | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 10 ml borosilicate Pipets | Fisher Scientific | 13-678-25E | |
| Borosilicate culture tubes | Fisher Scientific | 14-961-27 | |
| Uniskan I, ELISA plate reader | Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland | Type 362 |
Referências
- Georgieva, Y., Konthur, Z. Design and screening of M13 phage display cDNA libraries. Molecules. 16, 1667-1681 (2011).
- Beghetto, E., Gargano, N. Lambda-display: a powerful tool for antigen discovery. Molecules. 16, 3089-3105 (2011).
- Li, W. ORF phage display to identify cellular proteins with different functions. Methods. 58, 2-9 (2012).
- Willats, W. G. Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 50, 837-854 (2002).
- Konthur, Z., Crameri, R. High-throughput applications of phage display in proteomic analyses. Targets. 2, 261-270 (2003).
- Chen, T., et al. Substrates of the Arabidopsis thaliana protein isoaspartyl methyltransferase 1 identified using phage display and biopanning. J. Biol. Chem. 285, 37281-37292 (2010).
- Jung, S., Honegger, A., Pluckthun, A. Selection for improved protein stability by phage display. J. Mol. Biol. 294, 163-180 (1999).
- Battaglia, M., Olvera-Carrillo, Y., Garciarrubio, A., Campos, F. The enigmatic LEA proteins and other hydrophilins. Plant Physiol. 148, 6-24 (2008).
- Egli, D. B., Bruening, W. P. Source-sink relationships, seed sucrose levels and seed growth rates in soybean. Ann. Botany. 88, 235-242 (2001).
- Badotti, F., et al. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7, 4 (2008).
- Kushwaha, R., Lloyd, T. D., Schafermeyer, K. R., Kumar, S., Downie, A. B. Identification of Late Embryogenesis Abundant (LEA) Protein Putative Interactors Using Phage Display. Int. J. Mol. Sci. 13, 6582-6603 (2012).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm of Escherichia coli. Microb. Cell Fact. 4, 2859 (2005).
- Gasser, B., et al. Protein folding and conformational stress in microbial cells producing recombinant proteins: a host comparative overview. Microb. Cell Fact. 7, 11 (2008).
- Daly, R., Hearn, M. T. W. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris: a useful experimental tool in protein engineering and production. J. Mol. Recognit. 18, 119-138 (1002).
- Davis, T. R., et al. Comparative recombinant protein production of eight insect cell lines. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 29, 388-390 (1993).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23, 567-575 (2005).
- Popescu, S. C., et al. Differential binding of calmodulin-related proteins to their targets revealed through high-density Arabidopsis protein microarrays. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 4730-4735 (2007).
- Popescu, S. C., Snyder, M., Dinesh-Kumar, S. Arabidopsis protein microarrays for the high-throughput identification of protein-protein interactions. Plant Signal Behav. 2, 416-420 (2007).
- Al-Fageeh, M. B., Marchant, R. J., Carden, M. J., Smales, C. M. The cold-shock response in cultured mammalian cells: Harnessing the response for the improvement of recombinant protein production. Biotechnol. Bioeng. 93, 829-835 (2006).
- Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat. Biotechnol. 22, 1393-1398 (2004).
