Détecter des altérations génétiques somatiques dans des échantillons de tumeurs par Exon et le séquençage massivement parallèle
Summary
Nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et ultérieure capture d'exon base hybridation pour la détection de mutations clés associés au cancer dans des échantillons de tumeurs cliniques par séquençage massivement parallèle "prochaine génération". Séquençage de l'exon ciblée offre les avantages d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, donnant ainsi une grande sensibilité pour la détection de mutations de basse fréquence.
Abstract
Les efforts visant à détecter et enquêter sur des mutations oncogènes clés sont révélés précieux pour faciliter le traitement approprié pour les patients atteints de cancer. La mise en place de haut-débit, le séquençage massivement parallèle "nouvelle génération" a aidé la découverte de beaucoup de ces mutations. Pour améliorer l'utilité clinique et translationnelle de cette technologie, les plates-formes doivent être à haut débit, le coût-efficace, et compatible avec de la paraffine fixés au formol (FFPE) intégré échantillons de tissus qui peuvent donner de petites quantités d'ADN dégradé ou endommagé. Ici, nous décrivons la préparation de banques d'ADN code-barres et multiplexés suivie d'une hybridation de capture sur la base-des exons ciblés pour la détection de mutations associées au cancer dans les tumeurs congelées et FFPE fraîches par séquençage massivement parallèle. Cette méthode permet l'identification de mutations de la séquence, le nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant tous les gènes ciblés. Séquençage de l'exon offres ciblées til bénéficie d'un débit élevé, faible coût, et la couverture de séquence profond, conférant ainsi une haute sensibilité pour détecter des mutations de basse fréquence.
Introduction
L'identification des événements génétiques tumorales «driver» dans oncogènes clés et des gènes suppresseurs de tumeurs joue un rôle essentiel dans le diagnostic et le traitement de nombreux cancers 1. Efforts de recherche à grande échelle en utilisant le séquençage massivement parallèle "nouvelle génération" ont permis l'identification de plusieurs de ces gènes associés au cancer au cours des dernières années 2. Cependant, ces plates-formes de séquençage nécessitent généralement de grandes quantités de l'ADN isolé à partir de tissus congelés frais, ce qui présente donc une limitation importante dans l'analyse et la caractérisation des mutations de l'ADN à partir de tissus conservés, tels que la paraffine fixés au formol noyé (FFPE) des échantillons de tumeurs. Amélioration des efforts pour caractériser efficacement et de manière fiable l'information génomique "action" d'échantillons tumoraux FFPE permettront l'analyse rétrospective d'échantillons précédemment mis en réserve et encourager davantage les approches individualisées à la gestion du cancer.
Traditionnellement, d moléculairelaboratoires iagnostic se sont appuyés sur fastidieuses, des méthodologies bas-débit telles que le séquençage Sanger et PCR en temps réel pour le profilage ADN mutation. Plus récemment, des méthodes plus-débit utilisant la PCR multiplex ou spectrométrie de masse génotypage ont été développées pour étudier des mutations somatiques récurrentes dans les gènes du cancer clés 3-5. Ces approches sont cependant limitées par le fait que seuls les "points chauds" mutations prédésignés sont dosés, ce qui les rend impropres à la détection de mutations d'inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs. Séquençage massivement parallèle offre plusieurs avantages par rapport à ces stratégies, y compris la possibilité d'interroger les exons entiers pour les mutations à la fois communs et rares, la capacité de révéler d'autres catégories d'altérations génomiques tels que les gains et les pertes du nombre de copies, et une plus grande sensibilité de détection dans des échantillons hétérogènes 6, 7 . Séquençage du génome entier représente l'approche la plus complète pour la découverte de la mutation, si elle est relativement coûteux et encourt grandes exigences de calcul pour l'analyse des données et le stockage.
Pour les applications cliniques, où seule une petite fraction du génome peut être d'intérêt clinique, deux innovations particulières dans la technologie de séquençage ont eu un effet transformateur. Tout d'abord, à travers l'exon capture à base d'hybridation, on peut isoler l'ADN correspondant à des gènes associés au cancer clés de mutation ciblée profilage 8,. Deuxièmement, grâce à la ligature des codes-barres moléculaires (par exemple des séquences d'ADN 6-8 nucléotides de long), on peut regrouper des centaines d'échantillons par séquençage terme et profiter pleinement de la capacité croissante des instruments massivement parallèles de séquençage 10. Lorsqu'ils sont combinés, ces innovations permettent tumeurs être profilée pour un coût moindre et à un débit plus élevé, avec des exigences de calcul plus petits 11. En outre, par la redistribution de la couverture de séquence avec seulement les gènes les plus critiques pour l'application particulière, on peut Achieve plus grande profondeur de séquençage pour la sensibilité de détection plus élevé pour les événements de basse fréquence de l'allèle.
Nous décrivons ici notre test IMPACT (Mutation profilage intégrée des objectifs du cancer à une action), qui utilise l'exon capture sur un code à barres piscines de la bibliothèque de séquence par hybridation en utilisant personnalisés oligonucléotides pour capturer tous les exons codant pour des protéines et sélectionnez introns de 279 gènes associés au cancer clés (tableau 1 ). Cette stratégie permet l'identification de mutations, indels, nombre de copies des modifications, et sélectionner réarrangements structuraux impliquant ces 279 gènes. Notre méthode est compatible avec l'ADN isolé à partir de deux tissus congelés et FFPE frais ainsi que de fines aspire à aiguilles et d'autres spécimens de cytologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre essai IMPACT produit un taux élevé d'alignement, le taux sur la cible haut, couverture cible haute et haute sensibilité pour la détection des mutations, indels, et du nombre de copies des modifications. Nous avons démontré la capacité de notre essai IMPACT à l'ADN de séquence à la fois frais congelé et archivé échantillons FFPE de faible apport d'ADN. En effectuant le séquençage de l'exon ciblé de gènes associés au cancer principaux, on peut obtenir une couverture de séquence tr?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Agnès Viale et le MSKCC génomique Laboratoire central d'assistance technique. Ce protocole a été élaboré avec le soutien du Centre de Cancérologie Geoffrey Beene et la Fondation fermier de famille.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Referências
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