זיהוי שינויים גנטיים סומטי בדגימות גידול על ידי לכידת אקסון וריצוף מקביל מסיבי
Summary
אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ולכידת אקסון הבא המבוסס על הכלאה לזיהוי של מוטציות סרטן קשור מפתח בדגימות גידול קליניים על ידי רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי. רצף אקסון ממוקד מציע יתרונות של תפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מניב רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.
Abstract
מאמצים כדי לאתר ולחקור מוטציות בשעור מפתח הוכיחו יקרים כדי להקל על הטיפול המתאים לחולי סרטן. הקמתה של תפוקה גבוהה, רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי סייעה גילוי מוטציות רבות כאלה. כדי לשפר את התועלת הקלינית וtranslational של טכנולוגיה זו, פלטפורמות חייבת להיות תפוקה גבוהה, יעיל וחסכוני, ותואם עם פרפין קבוע פורמלין המוטבע (FFPE) דגימות רקמה שעשויה להניב כמויות קטנות של DNA המושפל או פגום. כאן, אנו מתארים את ההכנה של ספריות ה-DNA המינימרקטים ומרובבים ואחרי לכידה המבוססת על הכלאה של אקסונים ממוקדים לזיהוי של המוטציות סרטניות הקשורים בגידולי מזון קפואים וטריים FFPE ידי רצף מקביל מסיבי. שיטה זו מאפשרת זיהוי של מוטציות ברצף, להעתיק שינויי מספר, ובחר שחלופים מבניים המערבים את כל הגנים הממוקדים. רצף אקסון ממוקד מציע tהוא נהנה מתפוקה גבוהה, עלות נמוכה, וכן כיסוי רצף עמוק, ובכך מקנה רגישות גבוהה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה.
Introduction
זיהוי של אירועים הגנטיים של גידול "נהג" באונקוגנים מרכזיים וגני מדכאי סרטן ממלא תפקיד חיוני באבחון וטיפול בסוגי הסרטן רבים 1. מאמצי מחקר בקנה מידה גדול, תוך ניצול רצף "הדור הבא" מקביל מסיבי אפשרו זיהוי של גנים הקשורים לסרטן רבים כאלה בשנים האחרונות 2. עם זאת, פלטפורמות רצף אלה בדרך כלל דורשות כמויות גדולות של DNA שבודדו מרקמות קפואים, ובכך פוזות מגבלה עיקריות באפיון וניתוח מוטציות דנ"א מרקמות השתמרו, כגון פרפין קבוע פורמלין המוטבע (FFPE) דגימות גידול. מאמצים השתפרו אמינות וביעילות כדי לאפיין מידע "תביעה" גנומי מדגימות גידול FFPE יאפשר הניתוח רטרוספקטיבי של דגימות בעבר הפקידה ועוד יותר לעודד גישות אישיות של ניהול בסרטן.
באופן מסורתי, ד המולקולרימעבדות iagnostic יש לסמוך על זמן רב, מתודולוגיות נמוכה תפוקה כגון סנגר רצף וזמן אמת PCR לאפיון המוטציה בדנ"א. לאחרונה, שיטות גבוהה יותר תפוקה ניצול PCR המרובב או גנוטיפ ספקטרומטריה פותחו כדי לחקור מוטציות סומטיות חוזרות בגנים סרטניים מפתח 3-5. גישות אלה, עם זאת, מוגבלות בכי רק מוטציות "נקודה חמה" predesignated הם assayed, מה שהופך אותם מתאימים לאיתור מוטציות inactivating בגנים מדכאי סרטן. ריצוף מקביל מסיבי מציע מספר יתרונות על פני אסטרטגיות אלה כוללים את היכולת לחקור כל אקסונים למוטציות הן נפוצות ונדירות, היכולת לחשוף שיעורים נוספים של שינויים גנומיים כגון רווחים של מספר עותקים והפסדים, ורגישות גילוי גדולה יותר בדגימות הטרוגנית 6, 7 . רצף הגנום כולו מייצג את הגישה המקיפה ביותר לגילוי מוטציה, למרות שזה יחסיly יקר וכרוך בדרישות חישובית גדולות לניתוח ואחסון נתונים.
ליישומים קליניים, שבו רק חלק קטן של הגנום עשוי להיות עניין קליני, שני חידושים מסוימים ברצף טכנולוגיה היו טרנספורמטיבי. ראשית, דרך לכידת אקסון מבוסס הכלאה, אפשר לבודד DNA מתאים לגנים סרטניים הקשורים מפתח לפרופיל מוטציה ממוקד 8,. שנית, באמצעות קשירה של ברקודים המולקולריים (רצפי DNA כלומר 6-8 נוקלאוטידים באורך), אחד יכול בריכה מאות דגימות לריצת רצף ולקחת באופן מלא את יתרון של היכולת ההולכת והגוברת של מכשירי רצף מקבילים מסיבי 10. כאשר הוא משולב, חידושים אלו מאפשרים גידולים להיות צדודית עבור עלות נמוכה יותר ובתפוקה גבוהה יותר, עם דרישות חישובית קטנות 11. יתר על כן, על ידי חלוקה מחדש של כיסוי רצף רק לגנים הקריטיים ביותר ליישום המסוים, אפשר achieיש עומק רצף גדול יותר לגילוי רגישות גבוהות יותר לאירועים בתדירות אלל נמוכים.
כאן אנו מתארים assay שלנו IMPACT (Integrated מוטצית פרופיל של מטרות שניתן לפעול למלחמה בסרטן), אשר מנצל לכידת אקסון על בריכות ספריית רצף המינימרקטים על ידי הכלאה באמצעות oligonucleotides המותאמת אישית כדי ללכוד את כל אקסונים המקודדים החלבונים ובחר אינטרונים של 279 גנים סרטניים הקשורים מפתח (טבלת 1 ). אסטרטגיה זו מאפשרת זיהוי של מוטציות, indels, שינויי עותק מספר, ובחר שחלופים מבניים מעורבים 279 הגנים האלה. השיטה שלנו היא בקנה אחד עם DNA שבודד משני רקמות קפואים וFFPE כמו גם aspirates מחט הדק ודגימות ציטולוגיה אחרות.
Protocol
Representative Results
Discussion
assay ההשפעה שלנו מייצר שיעור גבוה יישור, שיעור על היעד גבוה, כיסוי יעד גבוה, ורגישות גבוהה למוטציות איתור, indels, ולהעתיק את שינויי מספר. אנחנו הוכיחו את היכולת של assay ההשפעה שלנו ל-DNA רצף מקפוא והן בארכיון דגימות FFPE של קלט DNA הנמוך. על ידי ביצוע רצף אקסון ממוקד של גנים הקשור?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד"ר אגנס ויאלה ומעבדת Core ג'נומיקס MSKCC לקבלת סיוע טכני. פרוטוקול זה פותח בתמיכת המרכז לחקר סרטן Beene ג'פרי וקרן פארמר המשפחה.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Referências
- Stratton, M. R., Campbell, P. J., Futreal, P. A. The cancer genome. Nature. 458 (7239), 719-724 (2009).
- Meyerson, M., Gabriel, S., Getz, G. Advances in understanding cancer genomes through second-generation sequencing. Nat. Rev. Genet. 11 (10), 685-696 (2010).
- Thomas, R. K., Baker, A. C., Debiasi, R. M., et al. High-throughput oncogene mutation profiling in human cancer. Nat. Genet. 39 (3), 347-351 (2007).
- Macconaill, L. E., Campbell, C. D., Kehoe, S. M., et al. Profiling critical cancer gene mutations in clinical tumor samples. PLoS One. 4 (11), e7887 (2009).
- Dias-Santagata, D., Akhavanfard, S., David, S. S., et al. Rapid targeted mutational analysis of human tumours: a clinical platform to guide personalized cancer medicine. EMBO Mol. Med. 2 (5), 146-158 (2010).
- Macconaill, L. E., Van Hummelen, P., Meyerson, M., Hahn, W. C. Clinical implementation of comprehensive strategies to characterize cancer genomes: opportunities and challenges. Cancer Discov. 1 (4), 297-311 (2011).
- Taylor, B. S., Ladanyi, M. Clinical cancer genomics: how soon is now. J. Pathol. 223 (2), 318-326 (2011).
- Gnirke, A., Melnikov, A., Maguire, J., et al. Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing. Nat. Biotechnol. 27 (2), 182-189 (2009).
- Mamanova, L., Coffey, A. J., Scott, C. E., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nat. Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
- Craig, D. W., Pearson, J. V., Szelinger, S., et al. Identification of genetic variants using bar-coded multiplexed sequencing. Nat. Methods. 5 (10), 887-893 (2008).
- Wagle, N., Berger, M. F., Davis, M. J., et al. High-throughput detection of actionable genomic alterations in clinical tumor samples by targeted, massively parallel sequencing. Cancer Discov. 2 (1), 82-93 (2012).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Depristo, M. A., Banks, E., Poplin, R., et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat. Genet. 43 (5), 491-498 (2011).
- Robinson, J. T., Thorvaldsdottir, H., Winckler, W., et al. Integrative genomics viewer. Nat. Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
- Cibulskis, K., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Sensitive detection of somatic point mutations in impure and heterogeneous cancer samples. Nat. Biotechnol. 31 (3), 213-219 (2013).
- Larson, D. E., Harris, C. C., Chen, K., et al. SomaticSniper: identification of somatic point mutations in whole genome sequencing data. Bioinformatics. 28 (3), 311-317 (2012).
- Saunders, C. T., Wong, W. S., Swamy, S., Becq, J., Murray, L. J., Cheetham, R. K. Strelka: Accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Albers, C. A., Lunter, G., Macarthur, D. G., Mcvean, G., Ouwehand, W. H., Din del Durbin, R. Accurate indel calls from short-read data. Genome Res. 21 (6), 961-973 (2011).
- Li, S., Li, R., Li, H., et al. Efficient identification of indels from short paired reads. Genome Res. 23 (1), 195-200 (2013).
- Sindi, S., Helman, E., Bashir, A., Raphael, B. J. A geometric approach for classification and comparison of structural variants. Bioinformatics. 25 (12), 222-230 (2009).
- Chen, K., Wallis, J. W., Mclellan, M. D., et al. BreakDancer: an algorithm for high-resolution mapping of genomic structural variation. Nat. Methods. 6 (9), 677-681 (2009).
- Wang, J., Mullighan, C. G., Easton, J., et al. CREST maps somatic structural variation in cancer genomes with base-pair resolution. Nat. Methods. 8 (8), 652-654 (2011).
- Drier, Y., Lawrence, M. S., Carter, S. L., et al. Somatic rearrangements across cancer reveal classes of samples with distinct patterns of DNA breakage and rearrangement-induced hypermutability. Genome Res. 23 (2), 228-235 (2012).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
- Roychowdhury, S., Iyer, M. K., Robinson, D. R., et al. Personalized oncology through integrative high-throughput sequencing: a pilot study. Sci. Transl. Med. 3 (111), 111ra121 (2011).
- Kerick, M., Isau, M., Timmermann, B., et al. Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Med. Genomics. 4, 68 (2011).
