Rilevamento somatici genetiche Alterazioni in campioni tumorali da Exon Capture e Sequencing Massively Parallel
Summary
Descriviamo la preparazione di librerie di DNA codici a barre e la successiva base di ibridazione-esone cattura per la rilevazione di mutazioni tumorali associate chiave in campioni tumorali clinici di massively parallel sequencing "prossima generazione". Mirato esone sequenziamento offre i vantaggi di elevata produttività, basso costo, e la copertura sequenza profondo, ottenendo così elevata sensibilità per la rilevazione delle mutazioni a bassa frequenza.
Abstract
Gli sforzi per individuare e indagare principali mutazioni oncogene si sono rivelate preziose per facilitare il trattamento appropriato per i pazienti oncologici. L'istituzione di high-throughput, massicciamente parallelo sequenziamento "next-generation" ha favorito la scoperta di molte di queste mutazioni. Per migliorare l'utilità clinica e traslazionale di questa tecnologia, piattaforme devono essere ad alta produttività, conveniente e compatibile con paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni di tessuto che possono produrre piccole quantità di DNA degradato o danneggiato. Qui, descriviamo la preparazione di librerie di DNA barcode e multiplex seguite da base di ibridazione-cattura di esoni mirati per la rilevazione delle mutazioni tumorali associate a tumori freschi congelati e FFPE di sequenziamento massivamente parallelo. Questo metodo consente l'identificazione di mutazioni di sequenza, copia numero di alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono tutti i geni target. Mirato esone sequenziamento offre tegli beneficia di throughput elevato, a basso costo, e la copertura sequenza profondo, conferendo ad alta sensibilità per la rilevazione di mutazioni a bassa frequenza.
Introduction
L'identificazione di "driver" tumorali eventi genetici in oncogeni chiave e geni oncosoppressori gioca un ruolo essenziale nella diagnosi e nel trattamento di molti tumori 1. Attività di ricerca su larga scala che utilizzano massicciamente parallelo sequenziamento "next-generation" hanno permesso l'identificazione di molti di questi geni del cancro-associata negli ultimi anni 2. Tuttavia, queste piattaforme di sequenziamento in genere richiedono grandi quantità di DNA isolate da tessuti freschi congelati, ponendo così una limitazione importante nella caratterizzazione e l'analisi di mutazioni del DNA dai tessuti conservati, come la paraffina fissato in formalina incorporato (FFPE) campioni tumorali. Miglioramento sforzi per caratterizzare in modo efficiente e affidabile informazioni genomiche "fruibili" da campioni tumorali FFPE consentiranno l'analisi retrospettiva di campioni precedentemente sopraelevate e ulteriormente incoraggiare approcci individualizzati alla gestione del cancro.
Tradizionalmente, d molecolarelaboratori iagnostic hanno fatto affidamento su termini di tempo, metodologie a basso rendimento come il sequenziamento Sanger e real-time PCR per la mutazione del DNA profiling. Più di recente, i metodi più elevato throughput utilizzando PCR multiplex o spettrometria di massa genotipizzazione sono stati sviluppati per studiare le mutazioni somatiche ricorrenti nei geni chiave del cancro 3-5. Questi approcci, tuttavia, sono limitati dal fatto che solo "hotspot" mutazioni predesignated vengono dosati, che li rende inadatti per la rilevazione delle mutazioni inattivanti nei geni oncosoppressori. Sequenziamento massivamente parallelo offre diversi vantaggi rispetto a queste strategie, tra cui la possibilità di interrogare interi esoni per le mutazioni sia comuni che rare, la capacità di rivelare ulteriori classi di alterazioni genomiche quali utili e perdite del numero di copie, e una maggiore sensibilità di rilevazione in campioni eterogenei 6, 7 . Intero sequenziamento del genoma rappresenta l'approccio più completo per la scoperta mutazione, anche se è relativoly costoso e comporta grandi esigenze computazionali per l'analisi e l'archiviazione dei dati.
Per le applicazioni cliniche, dove solo una piccola frazione del genoma può essere di interesse clinico, due particolari innovazioni nella tecnologia di sequenziamento sono stati trasformativa. In primo luogo, attraverso la cattura esone basato sull'ibridazione, si può isolare DNA corrispondente ai geni cancro-associate chiave per mirata mutazione profiling 8,. In secondo luogo, attraverso la legatura di codici a barre molecolare (cioè sequenze di DNA 6-8 nucleotidi di lunghezza), si possono riunire centinaia di campioni per analisi di sequenziamento e di sfruttare appieno la crescente capacità degli strumenti di sequenziamento massivamente parallelo 10. Quando combinati, queste innovazioni consentono di tumori ad essere sagomate per i costi più bassi e in un throughput più elevato, con minori requisiti di calcolo 11. Inoltre, ridistribuendo copertura della sequenza soltanto a quei geni più critici per la particolare applicazione, si può Achieve maggiore profondità di sequenziamento per la sensibilità di rilevazione più elevato per gli eventi a bassa frequenza allele.
Qui descriviamo il nostro impatto saggio (Integrated Mutazione Profiling di obiettivi Actionable Cancro), che utilizza la cattura esone su piscine Biblioteca sequenza di codici a barre mediante ibridazione con oligonucleotidi personalizzate per catturare tutti gli esoni codificanti proteine e selezionare introni di 279 geni del cancro-associata chiave (Tabella 1 ). Questa strategia consente l'identificazione di mutazioni, indels, numero di copie alterazioni, e seleziona riarrangiamenti strutturali che coinvolgono questi 279 geni. Il nostro metodo è compatibile con il DNA isolato sia fresco tessuto congelato e FFPE nonché aspirati con ago sottile e altri campioni citologici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il nostro test IMPACT produce un alto tasso di allineamento, alto tasso on-target, elevata copertura di destinazione, e ad alta sensibilità per le mutazioni rilevamento, indels, e numero di esemplari alterazioni. Abbiamo dimostrato la capacità del nostro test IMPACT alla sequenza di DNA sia fresco congelato e archiviato campioni FFPE di ingresso DNA bassa. Eseguendo mirata esone sequenziamento dei geni del cancro-associata chiave, si può ottenere una copertura sequenza molto profondo per gli esoni di questi geni più…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Agnes Viale e il MSKCC Genomica Nucleo Laboratorio per l'assistenza tecnica. Questo protocollo è stato sviluppato con il sostegno della Geoffrey Beene Cancer Research Center e dalla Fondazione Farmer famiglia.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Referências
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