Erkennen Somatische Genetische Veränderungen in Tumorproben von Exon-Abscheidung und-Massively Parallel Sequencing
Summary
Wir beschreiben die Herstellung von mit Strichcode-DNA-Bibliotheken und die anschließende Hybridisierung Basis Exon Erfassung zur Erkennung von Schlüssel Krebs-assoziierten Mutationen in der klinischen Tumorproben von massiv parallelen Sequenzierung der "nächsten Generation". Gezielte Exon-Sequenzierung bietet die Vorteile der hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung, woraus sich eine hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.
Abstract
Die Bemühungen um die Aufdeckung und Untersuchung von Schlüssel onkogenen Mutationen sind wertvoll, um die geeignete Behandlung für Krebspatienten erleichtern bewährt. Die Errichtung von Hochdurchsatz, massiv parallel sequencing "nächsten Generation" die Entdeckung von vielen solcher Mutationen unterstützt. Um die klinische und translationale Nutzen dieser Technologie zu verbessern, müssen Plattformen mit hohem Durchsatz, kostengünstig und mit Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebeproben, die kleine Mengen von degradierten oder beschädigte DNA ergeben können kompatibel sein. Hier beschreiben wir die Herstellung von Barcode-und Multiplex-DNA-Bibliotheken, gefolgt von der Hybridisierung-basierte Erfassung von Exons für den Nachweis von Krebs-assoziierte Mutationen in frisch eingefroren und FFPE Tumoren durch massiv parallele Sequenzierung. Dieses Verfahren ermöglicht die Identifizierung von Sequenzmutationen, die Kopienzahl Änderungen, und wählen strukturelle Umlagerungen gezielte Einbeziehung aller Gene. Gezielte Exon-Sequenzierung bietet ter profitiert von hohen Durchsatz, geringe Kosten, und tiefe Sequenzabdeckung gelegt und somit hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Niederfrequenz-Mutationen.
Introduction
Die Identifizierung der "Fahrer" Tumor genetischen Ereignissen in Schlüssel Onkogene und Tumorsuppressorgene, spielt eine wesentliche Rolle bei der Diagnose und Behandlung vieler Krebsarten 1. Großforschungsanstrengungen massiv parallele Sequenzierung Verwendung "der nächsten Generation" haben die Identifizierung von vielen solcher Krebs-assoziierte Gene, die in den letzten Jahren 2 freigegeben. Allerdings sind diese Sequenzierungsplattformen erfordern in der Regel große Mengen an DNA aus gefrorenem Frischgewebe isoliert und so posiert eine große Einschränkung in der Charakterisierung und Analyse von DNA-Mutationen von konservierten Geweben, wie Formalin-fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Tumorproben. Verbesserte Bemühungen, effizient und zuverlässig charakterisieren "verwertbare" genomische Informationen aus FFPE Tumorproben die retrospektive Analyse von zuvor überhöhten Proben zu ermöglichen und weiter zu fördern, individuelle Ansätze, um Krebs-Management.
Traditionell Molekular diagnostic Labors auf zeitraubende, geringe Durchsatz-Methoden wie die Sanger-Sequenzierung und Echtzeit-PCR für DNA-Mutation Profilierung verlassen. Neuerdings höhere Durchsatzverfahren unter Verwendung von PCR oder Multiplex-Genotypisierung massenspektrometrischen entwickelt worden, um wiederkehrende somatische Mutationen in Schlüsselkrebsgene 3-5 untersuchen. Diese Ansätze sind jedoch dadurch begrenzt, daß nur vorbezeichneten "Hotspot"-Mutationen untersucht, so dass sie zur Detektion inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen ungeeignet. Massiv parallele Sequenzierung bietet mehrere Vorteile gegenüber diesen Strategien, einschließlich der Fähigkeit, ganze Exons für beide gemeinsame und seltene Mutationen zu verhören, die Fähigkeit, weitere Klassen von genomischer Veränderungen, die Kopienzahl Gewinne und Verluste zu offenbaren, und größere Nachweisempfindlichkeit in heterogenen Proben 6, 7 . Gesamtgenom-Sequenzierung stellt den umfassenden Ansatz für die Mutation Entdeckung, obwohl es relativ istly teuer und verursacht großen Rechenaufwand für die Datenanalyse und-speicherung.
Für klinische Anwendungen, bei denen nur ein kleiner Anteil des Genoms von klinischem Interesse sein, insbesondere zwei Innovationen in Sequenzierungstechnologie haben transformierende. Erstens, durch Hybridisierung Exon-basierten Erfassung, kann man DNA, die Taste Krebs-assoziierte Gene, die für eine gezielte Mutation Profilierung 8 isolieren. Zweitens, durch Ligation der molekularen Barcodes (dh DNA-Sequenzen 6-8 Nukleotide in der Länge), kann man Hunderte von Proben pro Sequenzierungslauf bündeln und voll die Vorteile der immer größeren Kapazität von massiv-parallele Sequenzierung 10 Instrumente. In Kombination ermöglichen diese Innovationen Tumoren, für niedrigere Kosten profiliert werden und bei höheren Durchsatz, mit kleineren Rechenanforderungen 11. Ferner kann durch die Umverteilung Sequenzabdeckung auf jene Gene am wichtigsten für die bestimmte Anwendung, eine Achie könnenve größer Sequenzierung Tiefe für höhere Nachweisempfindlichkeit für niedrige Allelfrequenz Veranstaltungen.
Hier beschreiben wir unsere IMPACT-Assay (Integrated Mutation Profiling von Action Krebs Targets), die Exon-Capture auf einer Barcode-Sequenzbibliothek Pools nutzt durch Hybridisierung unter Verwendung kundenspezifische Oligonukleotide, um alle Protein-kodierenden Exons zu erfassen und wählen Introns von 279 Schlüssel Krebs-assoziierte Gene (Tabelle 1 ). Diese Strategie ermöglicht die Identifikation von Mutationen, indels, Kopienzahl Änderungen, und wählen Sie Strukturänderungen im Zusammenhang mit diesen 279 Gene. Unsere Methode ist mit DNA aus sowohl frisch eingefroren und FFPE Gewebe sowie Feinnadelaspirate und andere Zellproben isoliert kompatibel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere IMPACT-Assay erzeugt eine hohe Rate Ausrichtung, hoch auf-Zielrate, hohe Zielabdeckung und hohe Empfindlichkeit zum Nachweis von Mutationen, indels, und Nummer des Exemplars Veränderungen. Wir haben die Leistungsfähigkeit unserer IMPACT-Assay auf DNA-Sequenz sowohl von frisch gefrorenem nachgewiesen und archiviert FFPE-Proben niedriger DNA-Eingang. Mit der Durchführung ziel Exon-Sequenzierung der wichtigsten Krebs-assoziierte Gene, kann man sehr tief Sequenzabdeckung für die Exons dieser kritischen Gene dadur…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Agnes Viale und die MSKCC Genomics Core-Labor für technische Hilfe. Dieses Protokoll wurde mit Unterstützung der Geoffrey Beene Krebsforschungszentrum und dem Farmer-Familien-Basis entwickelt.
Materials
| NEBNext End Repair Module | New England Biolabs | E6050L | |
| NEBNext dA-Tailing Module | New England Biolabs | E6053L | |
| NEBNext Quick Ligation Module | New England Biolabs | E6056L | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter Genomics | ||
| NEXTflex PCR-Free Barcodes – 24 | Bioo Scientific | 514103 | |
| HiFi Library Amplification Kit | KAPA Biosystems | KK2612 | |
| COT Human DNA, Fluorometric Grade | Roche Diagnostics | 05 480 647 001 | |
| NimbleGen SeqCap EZ Hybridization and Wash kit | Roche NimbleGen | 05 634 261 001 | |
| SeqCap EZ Library Baits | Roche NimbleGen | ||
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Qubit dsDNA Broad Range (BR) Assay Kit | Life Technologies | Q32850 | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Agilent DNA HS Kit | Agilent Technologies | 5067-4626, 4627 | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| Covaris E220 | Covaris | ||
| Magnetic Stand-96 | Ambion | AM10027 | |
| Illumina Hi-Seq 2000 | Illumina |
Referências
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