Summary
우리는 다중 미세 기반 항체 배열을 사용하여 타액 단백질 프로파일위한 절차를 설명한다. 단일 클론 항체는 공유 보디이 미드 화학을 사용하여 형광 염료로 인코딩 된 4.5 μm의 폴리머 마이크로 스피어에 연결되어 있었다. 변형 된 미소 구체는 형광 샌드위치 면역 분석을 사용하여 침의 단백질 수준을 측정하기 위해 광섬유 마이크로 웰에서 증착되었다.
Abstract
여기서, 우리는 동시에 광섬유 마이크로 스피어 계 항체 배열을 사용하여 침 육 단백질을 측정하기위한 프로토콜을 기술한다. 채용 면역 어레이 기술은 형광 현미경의 사용으로 미세 기반 서스펜션 어레이 제조의 이점을 결합한다. 비디오 프로토콜에서 설명한 바와 같이, 시판되는 4.5 ㎛의 중합체 미세 물리적 미소 구체 안에 갇혀이 형광 염료의 농도에 의해 분화 된 일곱 가지 유형으로 인코딩되었다. 표면에 카르복실기를 함유하는 미소 구체는 부호화 EDC / NHS 커플 링 화학을 통해 캡쳐 항체 모노클로 개질되었다. 단백질 마이크로 어레이를 조립하기 위해, 인코딩과 기능화 미소 구체의 다른 유형들을 혼합하고, 임의로 화학적 광섬유 다발의 기단부에 에칭 된 4.5 ㎛의 마이크로 웰, 증착. 광섬유 다발 반송로 양 및 m을 묘화에 사용 된icrospheres. 일단 조립, 마이크로 어레이는 병원에서 수집 된 타액 상등액에서 단백질을 캡처하는 데 사용 하였다. 검출은 스트렙 타비 딘 - 컨쥬 형광 프로브, R-피코 에리 트린을 가진 다른 분석을 위해 비 오티 닐화 된 검출 항체의 혼합물을 사용하여 샌드위치 면역 분석법을 기반으로했다. 마이크로 어레이 마이크로 스피어 등록 및 분석 신호 하나를 세 가지 채널, 두 형광 현미경에 의해 촬영되었다. 형광 현미경은 디코딩 및 MATLAB에서 제 알고리즘을 이용하여 분석 하였다.
Introduction
마크 Schena 1990 년대 중반에서 동료에 의해보고되는 최초의 마이크로 어레이 때문에,이 강력한 도구는 생물학 연구 1의 많은 분야에서 활용되고 있습니다. 동시에 혈액과 같은 체액 진단, 여러 단백질을 검출 할 수있는 항체 마이크로 어레이는, 임상 진단 및 바이오 마커 검사 2-10에서 중요한 응용 프로그램이 있습니다. 타액, 혈액과 같은 분석 물질의 많은 것을 포함하는, 타액 수집 안전한 비 침습적이므로 혈액 바람직한 대안으로 간주되었으며, 최소한 숙련 된 의료인 11-13에 의해 수행 될 수있다. 현재, 타액으로 다중화 단백질 분석은 표적 피 분석 물 (14)의 낮은 농도와 상이한 바이오 마커 (15)의 넓은 농도 범위를 포함하여 여러 가지 중요한 요인에 의해 제한된다.
.여기서, 우리는 육 단백질의 분석을 설명 : 인간 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 인터페론 감마 - 유도 단백질 10 (IP-10), 인터루킨 -8 (IL-8), 표피 성장 인자 (EGF), 매트릭스 metallopeptidase 9 (MMP-9) 및 인터루킨 -1 베타 (IL-1β) . 방법의 성능은 초기 분석 재조합 단백질을 구성하고 차단 완충액의 표준 용액을 사용하여 확인 하였다. 다른 만성 호흡기 질환의 환자뿐만 아니라 건강한 대조군에서 수집 된 실제 타액 샘플도 만족스러운 성능을 시험 하였다. 이 프로토콜은 다른 단백질 분석 및 기타 마이크로 스피어 기반의 분석에 적용 할 수 있어야합니다. 그것과 비교하여 넓은 동적 범위, 최소한의 비특이적 상호 작용을 감소 샘플 소모 및 저렴한 비용으로 여러 단백질의 낮은 농도의 빠르고 정확하고 재현성 동시 분석을 가능으로이 플랫폼은 분석 화학 분야에 상당한 이점을 제공한다 유사한 효소 결합 면역 분석 (ELISA).
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Protocol
그림 1. . 침 프로파일에 광섬유 미세 항체 어레이를 적용하는 작업 흐름 (1) 마이크로 스피어가 내부적이 형광 염료를 사용하여 인코딩되며, (2) 상기 인코딩 된 미소 구체는 외부 단백질 특이 모노클로 날 항체로 수정되고, (3), 다중화 미소 구체를 혼합, (5) 타액 단백질은 샌드위치 면역 측정법을 통해 미소 구에 의해 캡쳐되고, (6) 형광 현미경을 이용하여 정량화하고, (4) 임의로 광섬유 다발의 기단부에 에칭 마이크로 웰에 침착.
1. 마이크로 스피어 인코딩
- 호박 유리 병에 나트륨 유로퓸 (III) thenoyltrifluoroacetonate 삼수화물 (EU-TTA, MW = 869.54 g / 몰)을 달아 테트라 하이드로 퓨란 (THF)에 200 밀리미터 주식 솔루션을 준비합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합, 시각적으로 확인염료가 완전히 용해된다.
- 호박 유리 병에 쿠마린 30 (C30, MW = 347.41 g / 몰)을 달아 THF에서 12 밀리미터 주식 솔루션을 준비합니다. 피펫으로 부드럽게 혼합, 시각적으로 염료가 완전히 용해되어 있는지 확인합니다.
- 표 1에 기재된 최종 농도에 도달하는 스톡 용액 및 THF를 사용하여 각 미세 분류를위한 작업 용액 700 μl를 준비한다.
- 마이크로 스피어 (10 % W / V)도 소용돌이로 교반에 의해 중단하고 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 60 ㎕의 현탁액을 전송되어 있는지 확인합니다.
- 미세 현탁액에 600 ㎕의 PBS를 추가하고 20 배를 피펫으로 혼합한다. 3 분 동안 10,000 rpm으로 튜브를 원심 분리기 조심스럽게 뜨는을 제거합니다. 미세 세척이 프로세스 또 다른 배를 반복합니다.
- THF 단계 1.5와 유사한 절차를 이용하여 미세 펠렛의 3 배를 씻으십시오.
- 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 / THF 현탁액을 원심 분리기, 뜨는을 제거하고 600 μL에 펠렛을 다시 일시 중지작업 용액은 표 1에 나열된. 새로운 1.5 밀리리터 microcentrifuge 관에 혼합물을 전송.
- 파라 필름으로 microcentrifuge 관을 밀봉하고 통에 놓습니다. 3,000 rpm으로 흔들어 24 시간 동안 배양, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 설치를 덮어 빛으로부터 보호합니다.
- 펠릿을 형성하는 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기.
- 단계 1.5에 설명 된 상등액 염료 용액을 제거, 0.01 % 트윈 -20을 함유하는 다른 6X 600 ㎕의 PBS로 한 다음 미세 600 μL 메탄올로 씻어 6X.
- 사용할 때까지, 빛으로부터 보호하는 4 ° C에서 0.01 % 트윈 20을 포함하는 600 ㎕의 PBS에 인코딩 미소를 저장합니다.
| 마이크로 스피어 유형 이름 : | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| 유럽 연합 (EU) - TTA (MM) | (100) | (100) | 10 | (100) | 10 | ||
| C30 (MM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
표 1. 같은 유럽 TTA와 C30의 농도는 솔루션을 작동합니다.
2. 단백질 캡처 마이크로 스피어의 제조
- [- (N-모르 폴리 노) 에탄 설 폰산 (MES) 0.1 M, 염화나트륨 0.9 %, SDS 0.01 %, 산도 5.7 2] PBS / SDS 버퍼 (나트륨 인산염 0.01 M, 염화나트륨 0.154 M, SDS 0.01 %, pH가 MES는 버퍼 준비 7.4) 실온에서 미리.
- 안전 잠금 1.5 ML microcentrifuge 관에 (~ 2 밀리그램의 미소를 포함) 200 ㎕의 인코딩 된 미세 현탁액을 추가합니다. 이 단계 2.6에서 배양시 누유를 방지하기 microcentrifuge 관이 유형을 사용하는 것이 중요하다. <리> 단계 1.5에 설명 된대로 배를 버퍼 600 μL의 MES와 미소를 씻으십시오. 마이크로 스피어 펠릿에 700 μL의 MES를 추가하고 피펫으로 잘 섞는다.
- 준비 0.105 g / ml의 1 - 에틸 -3 - [3 - 디메틸 아미노 프로필] 카 보디이 미드 하이드로 클로라이드 (EDC, MW = 191.7 g / mol) 및 0.163 g / ㎖ 술포-N-히드 록 (설포-NHS, MW = 217.13 g / mol)의 별도의 튜브에있는 MES 버퍼 솔루션을 제공합니다.
- 갓 마이크로 스피어 현탁액에 드롭으로 EDC 솔루션 드롭을 준비 150 μl를 추가합니다. EDC 따라서 그것은 고정화 효율을 보장하기 위해 갓 만든 솔루션을 사용하는 것이 필수적입니다, 매우 빠르게 가수 분해한다. 즉시 EDC의 추가 후, 미세에 150 ㎕의 설포-NHS의 솔루션을 추가 피펫으로 잘 섞어 현탁액이 균질 확인합니다.
- 튜브 캡을 파라 필름으로 밀봉 통에 놓습니다. 4 시간 동안 1,500 rpm으로 흔들어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
- 마이크로 스피어 펜던트 핀을 원심 분리기펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 10,000 rpm에서 이온. 단계 1.5에 설명 된대로 500 ㎕의 PBS / SDS 버퍼 배에 미소를 씻으십시오.
- 펠릿에 200 ㎕의 PBS / SDS 버퍼를 추가 물론 미세 혼합 60 μg 캡처 항체를 포함하는 300 ㎕의 PBS / SDS 버퍼에 솔루션을 전송합니다. 먼저 미세 펠렛을 일시 중단 한 후 항체 용액에 미세 현탁액을 추가하는 것이 중요합니다.
- , 셰이커에 4 시간 동안 1,500 rpm으로 흔들어 항체 마이크로 혼합물을 품어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
- 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 10,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기. 500 μL의 StartingBlock (TBS) 단계 1.5에 설명 된대로, 버퍼의 3 배를 차단과 미세을 씻으십시오.
- 버퍼를 차단 TBS 1 ㎖에 미소를 혼합 상자 코브를 사용하여 빛으로부터 보호, 쉐이커에 1 시간 동안 1,500 rpm에서 미소를 품다알루미늄 호일 빨간색.
- 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 7,000 rpm으로 미세 현탁액을 원심 분리기. 단계 1.5에 설명 된대로 500 μL의 TBS가, 차단 버퍼와 펠렛 배를 씻으십시오.
- 펠렛을 형성하고, 상층 액을 제거하기 위해 3 분 동안 7,000 rpm에서 마이크로 스피어 솔루션을 원심 분리기. 차단 버퍼 500 μL의 TBS를 추가하고 피펫으로 혼합한다.
- 빛으로부터 보호, 사용할 때까지 4 ° C에서 수정 된 미세 현탁액을 저장합니다.
- 해당 항체를 사용하여 마이크로의 다른 유형을 만들기 위해이 절차를 반복합니다.
3. 광섬유 마이크로 어레이 조립
- 새로운 멸균 microcentrifuge 관에 단백질 캡처 미소의 각 유형의 50 μl를 섞는다. 원심 분리기 주식 마이크로는 3 분 동안 7,000 rpm에서 풀, 나머지 볼륨이 약 100 μL가되도록 뜨는을 제거합니다.
- 손으로 컷 광섬유 길이 약 5cm에 번들순차적 필름 랩핑 30, 15, 15, 6, 3, 1, 0.5, 및 0.05 μm의 크기의 다이아몬드를 사용한 연마 장치에 양단 닦아. 모든 입자를 제거하기 위해 2 분 동안 탈 이온수 연마 번들을 초음파 처리.
- 0.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 작은 자석 교반 막대를 넣고, 단백질이없는 PBS 400 μL 버퍼와 공기 방울을 제거하기 위해 30 분 동안 자기 교반 판에 자극을 추가합니다.
- 150 초 10,16 대해 0.025 N HCl 용액으로 연마 섬유 다발의 일단을 에칭. 즉시 물속에 1 분 동안 탈 이온수에서 에칭 단부 초음파 처리. 압축 공기와 섬유 다발 말린다.
- 광섬유 홀더에 섬유 다발을 마운트하고 1 시간 동안 기포없이, 단백질이없는 PBS 버퍼에 에칭 단부 블록.
- 광섬유 다발의 에칭 끝의 저장 미세 현탁액 예금 1 μL 나누어지는. 알루미늄 호일 상자 빛에서 설정을 보호하고, 15 분 동안 기다립니다. 현탁액의 부피 것증발에 의해 감소하고 에칭 된 마이크로 웰에 미소 강제. 이로드 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 마이크로 웰에 갇혀되지 미소를 제거하기 위해 시료 용액으로 포화 면봉을 사용합니다. 단백질 마이크로 어레이는 이제 사용할 수 있습니다. 타액 분석을 위해 4.1 단계로 바로 이동합니다.
4. 마이크로 스피어 마이크로 어레이를 사용하여 침 샘플 분석
- 200 ㎕의 샘플 용액 (버퍼를 차단. 타액 상층의 수집 프로토콜은 이전에 10 게시 된 StartingBlock T20 (PBS)의 같은 부피로 희석하여 100 ㎕의 타액 상층 액)를 추가합니다. 0.5 ㎖ 멸균 microcentrifuge 관에. 용액에 섬유에로드 된 단백질 마이크로 어레이를 담그고 2 시간 동안 600 rpm으로 진탕 배양, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
- 10 % 트윈 20 19.6 ㎖의 PBS, 미시간에 200 ㎕의 10 % BSA 용액 200 μl를 추가하여 20 ㎖ 세척 버퍼를 준비합니다X도 부드럽게 흔들어.
- 200 μL 세척 버퍼를 포함하는 새로운 멸균 microcentrifuge 관에 단백질 마이크로 어레이를 담그고 2 분 동안 600 rpm으로 흔들. 이 세척의 배를 반복합니다.
- 항-VEGF, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9의 5 ㎍ / ㎖의를 포함하는 검출 항체 칵테일의 100 ㎕의 용액에 마이크로 어레이를 품어, StartingBlock T20에서 IL-1β 바이오틴 검출 항체 (PBS) 버퍼를 차단 600 rpm에서 진탕 기에서 실온에서 30 분 동안, 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호한다.
- 4.3 단계에 설명 된대로 세척 버퍼와 마이크로 어레이의 3 배를 씻으십시오.
- 10 분 동안 진탕 600 rpm에서 PBS에서 20 ㎍ / ㎖의 스트렙 타비 딘 R-피코 에리 트린의 어원 (SAPE) 솔루션을 200 μL의 마이크로 어레이를 품어 알루미늄 호일로 덮여 상자를 사용하여 빛으로부터 보호합니다.
- 4.3 단계에 설명 된대로 세척 버퍼와 마이크로 어레이의 5 배를 씻으십시오.
- 섬유 거리 (즉, 말의 말단부를 청소미세부터) 무수 에탄올로 포화 면봉과 함께 제공.
- 압축 공기와 함께 광섬유의 양단 말린다. 섬유의 말단부를 통해 epifluorescent 현미경 이미지 섬유를 장착합니다.
- 같은 유럽 TTA, C30, 및 SAPE 형광 방출 강도에 해당하는 마이크로 스피어 이미지를 획득. Eu를-TTA, C30 및 SAPE의 형광 이미징을위한 광학 필터 설치 및 노출 시간은 표 2에 도시된다.
| 채널 | 유럽 연합 (EU) - TTA | C30 | SAPE |
| 자극하는 사람 | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| 빔 스플리터 | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| 이미 터 | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| 노출 시간 | 1 초 | 0.3 초 | 1 초 |
표 2. 마이크로 어레이의 세 가지 형광 이미지의 매개 변수.
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Representative Results
광섬유 다발의 작은 단면을 나타내는 세 개의 채널로부터 형광 이미지는도 2A-C에 나타내었다. (토론 섹션에서보다 상세히 설명 됨)이 이미지는 MATLAB 작성 알고리즘을 이용하여 분석 하였다. 분석은 마이크로 스피어 디코딩을 EU의 TTA 부호화 화상 (도 2a)로부터의 정보 및 C30 부호화 화상 (도 2B) 모두를 채용하고, 신호 콘텐츠 (도 2c)의 다른 구체의 형광 강도를 계산 하였다. 상관 된 단백질로부터 얻은 표준 교정 곡선, 타액 샘플에서 단백질의 농도를 계산 하였다.
그림 2. (A)-TTA Eu를 부호화 콘텐츠, (B) C30 부호화 콘텐츠, (C) SAPE 신호 콘텐츠, (D) 복호 결과마이크로 여러 종류의 서로 다른 색상과 모양으로 표시했다;의 신호 이미지를 중첩.
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Discussion
연구팀은 다음 단계에 특별한주의를 지불해야한다 : 더 나은 해독 정확성을 위해, 그것은 미세 균일하게 모든 배양에 현탁 확인하고 미소 인코딩 절차에서 단계를 세척 할 필요가있다. 또, 부호화 된 미소 구체 전체 실험을하는 동안 광으로부터 보호 할 필요가있다. 적절한 인코딩 및 저장 절차에 따라, 우리는 전체 디코딩 정확도는 99 % 이상이었다 것으로 나타났습니다. 인코딩 된 마이크로 스피어 C. 동결을 피하고 빛으로부터 보호하는 4 ℃에서 보관해야합니다. 적절한 보관 조건에서 인코딩 된 마이크로 스피어가 6 개월 이상 안정적이다. 극도의주의가 미소 구체의 손실을 감소시키기 위해 인코딩 및 수정 단계에서 요구된다. 상층 액을 제거 할 때 예를 들어, 미세 펠렛을 방해하지 않습니다. 또한, 버퍼에 트윈 -20 및 SDS를 포함하여 더 미세 구 펠렛 필수적이다.
일부 oF 일반적인 해결 절차는 다음과 같다 : (1) (단 갓 준비한 EDC 용액을 사용하고 EDC 용액을 적가한다, (2) 멸균 튜브 표기 및 미세 액 각 배양 공정 전에 새로운 튜브로 전송되어야 3) 각 세척 단계 동안, 뜨는에게 가능한 한 많이 제거하려고 (4) 수정 된 마이크로는 4 ° C에서 보관해야합니다, 동결을 방지하고 빛으로부터 보호합니다. 적절한 보관 조건에서, 수정 된 마이크로 스피어에 저장 될 수있다 탐지 가능한 신호 손실이 3 개월 이상.
형광 이미지를 분석하는 데 사용 MATLAB 알고리즘은 아래에 간략하게 설명한다. 관련 코드는 보충 자료에서 찾을 수 있습니다. EU의 TTA 콘텐츠에 대한 사용자 정의 강도 범위 내의 픽셀이 먼저 필터링된다. 다른 지역은, 사이즈 필터와 함께 조사 하였다 광 감쇠로 인해 "중공"센터를 포함하는 영역을 제거하고 지역 위치미소가 존재하는 미래 처리를위한 감시 목록으로 분류되었다. 감시 목록에서 모든 미소가 더 해당 C30 이미지에 반응로 여과 하였다. 특히 마이크로 스피어의 모든 화소에 대한 신호가 평균화 하였다. 또한이 마이크로 스피어의 신호 강도는 워치리스트에있는 미소 구의 농도를 평균하여 계산 하였다. 결과는 통계적으로 대표하기 위해, 각 유형의 25 마이크로의 최소 요구되었다. 비특이적 신호를 최소화하고 다양한 실험 간의 편차를 줄이기 위하여, 모든 미세 유형의 신호는 제어 마이크로 스피어로부터의 신호를 감산하여 정규화 하였다.
미소 구체의 신호 응답은 넓은 범위의 농도를 가진 단백질의 다중 검출 최적 미립자의 표면에 고정화 된 항체의 양에 의해 조정될 수있다. 미소, t의 다른 직경에 따라그 구체에 단층을 형성하기 위해 필요한 항체의 양은 제조자 17 식에 의해 추정 될 수있다. 4.5 μm의 직경, 항체의 3 μg과 미소를 들어 마이크로의 1 밀리그램 당 필요합니다. 우리는 항체의 60 μg (10 배)로 3 μg (0.5 배)의 단계 2.8에서 커플 링 솔루션에 다른 항체 양을 테스트했습니다. 자세한 항체 용액에 사용했을 때 증가 된 신호가 관찰되었다. 다른 항체 및 응용 프로그램에 대한 최적의 항체 금액은 실험적으로 결정해야합니다. "제어 마이크로는"직접 ELISA에서 음성 대조군으로 제조업체가 제공되며 최대 40 재조합 인간 단백질 18 아무 교차 반응을 보이지 않고있다 마우스 이소 타입 IgG 항체와 결합되었다. 결합 방법의 재현성을 평가하기 위해, MMP-15이 미소 구의 배치가 다른 일에 결합 하였다. 미소의 성능은 multiplexe를 사용하여 테스트되었습니다10 NG / ML MMP-9의 D 탐지. 결과 (상세한 결과를 표 3에 나타낸다) 구체의 다른 배치들 사이에 유의 한 차이를 보이지 않았다.
| 아니 | 날짜 | 테스트 1 | 테스트 2 | 시험 3 | 평균 | 표준 |
| 1 | 2011/12/01 | 773.8 | 690.1 | 756.8 | 740.2 | 44.2 |
| 2 | 2011년 1월 26일 | 791.9 | 721.8 | 867.0 | 793.6 | 72.6 |
표 3. 커플 링 방법 (임의의 단위로 나타낸 결과)의 재현성.
여기에 제시된 다중화 방법은 빠르고 정확하고 재현성있게넓은 농도 범위 (표 4에 나와있는 결과) 이상의 서로 다른 단백질의 분석. 본 연구에 사용 된 항체 여섯 쌍에 대한 잠재적 인 교차 - 반응성은 또한 시험 하였다. 교차 - 반응성의 모든 신호는 (3 % 미만) 무시할 것으로 밝혀졌다. 이 방법의 다른 장점은, 종래의 효소 결합 면역 분석법 (ELISA)에 비해, 넓은 동적 범위, 최소 비특이적 상호 작용을 감소 샘플 소비와 저비용 열을 포함한다. 타액 샘플의 필요한 부피는 100 μL만큼 낮고 분석법에서 3.5 시간 이내에 완료 될 수있다. 다른 서스펜션 배열과 비교할 때,이 방법의 하나의 제한 사항은 마이크로 어레이가 조립 된 후, 검출 미만에서 15 분에 시작되어야한다는 것이다. 여기에서 설명하는 방법은 염증성 질환과 건강한 대조군 (게시되지 않은 데이터)를 가진 환자에서 수집 한 인간의 타액 샘플을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 방법은 적용되어야다른 복잡한 유체 시료의 단백질 분석. 유사한 마이크로 스피어 기반의 단백질 배열은 마이크로 유체 장치와 같은 다른 플랫폼에서 사용할 수 있습니다. 인코딩 및 고정 방법은 다른 물질 9로 만든 마이크로 스피어에 적용 할 수 있습니다.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| 테스트 1 | 5365.9 | 2578.4 | 6508.7 | 2584.0 | 515.5 | 1147.4 |
| 테스트 2 | 5787.8 | 2577.9 | 7238.9 | 2919.2 | 375.7 | 1099.2 |
| 시험 3 | 4944.6 | 2883.3 | 6726.3 | 3619.3 | 4,068 | 1084.1 |
| 평균 | 5366.1 | 2679.9 | 6824.6 | 3040.8 | 432.7 | 1110.2 |
| 표준. 데브 | 421.6 | 176.2 | 374.9 | 528.3 | 73.4 | 33.1 |
표 4. (임의의 단위로 나타낸 결과) 같은 타액 샘플에있는 세 개의 독립적 인 테스트의 결과.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 보건원 (부여 08UDE017788-05)에 의해 지원되었다. EBP는 과학 기술에 대한 스페인 재단 (FECYT)에서 지원을 인정합니다. 저자는 원고의 중요한 읽기 Shonda T. 게일로드와 Pratyusha Mogalisetti 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
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