Summary
Vi beskriver ett förfarande för profilering salivproteiner använda multiplexade mikrosfärbaserade arrayer antikroppar. Monoklonala antikroppar kovalent kopplade till fluorescerande färgämne-kodat 4,5 ìm polymermikrosfärer med hjälp karbodiimid kemi. De modifierade mikrosfärer avsattes i fiberoptiska mikrobrunnar för att mäta proteinnivåer i saliv med hjälp av fluorescens sandwichimmunoanalyser.
Abstract
Häri beskriver vi ett protokoll för att samtidigt mäta sex proteiner i saliv genom att använda en fiberoptisk mikrosfärbaserade antikropp array. Den immuno-array-teknologin utnyttjas kombinerar fördelarna med mikrosfärbaserat suspensions array tillverkning med användning av fluorescensmikroskopi. Som beskrivs i videon protokollet, var kommersiellt tillgängliga 4,5 ìm polymermikrosfärer kodas in i sju olika typer, uppdelade efter koncentrationen av två fluorescerande färger fysiskt fångade inuti mikrosfärerna. De kodade mikrosfärer innehållande ytan karboxylgrupper modifierades med monoklonala infångnings antikroppar via EDC / NHS kopplingskemi. För att sätta samman proteinmikroarray, de olika typer av kodade och funktionaliserade mikrosfärer blandades och slumpvis avsattes i 4,5 | im mikrobrunnar, som är kemiskt etsade vid den proximala änden av en fiberoptisk bunt. Det fiberoptiska knippet användes som både en bärare och för avbildning av microspheres. När monterad, var microarray som används för att fånga in proteiner i saliven supernatant uppsamlades från kliniken. Upptäckten bygger på en sandwich immunoassay med en blandning av biotinylerade antikroppar upptäckt för olika analyter med streptavidinkonjugerat fluorescerande sond, R-fykoerytrin. The microarray avbildades genom fluorescensmikroskopi i tre olika kanaler, två för mikrosfär registrering och en för analysen signalen. Fluorescensmikrofotografier sedan avkodas och analyseras med hjälp av en hemmagjord algoritm i MATLAB.
Introduction
Sedan den första microarray rapporterades av Mark Schena och medarbetare i mitten av 1990-talet, har detta kraftfulla verktyg använts inom många områden av biologisk forskning 1. Antikropps microarrays kan samtidigt upptäcka flera proteiner i diagnostiska vätskor, såsom blod, har viktiga tillämpningar inom klinisk diagnostik och biomarkör screening 2-10. Saliv, som innehåller många av de analyter som blod, har betraktats som ett bättre alternativ till blod eftersom saliv samling är säker, icke-invasiv, och kan utföras med minimalt utbildad medicinsk personal 11-13. För närvarande är multiplexerad proteinanalys med användning av salivprover begränsas av flera viktiga faktorer, inklusive den låga koncentrationen av målanalyt 14 och det breda koncentrationsintervall av olika biomarkörer 15.
.Häri visar vi en analys av sex proteiner: human vaskulär endotel tillväxtfaktor (VEGF), interferon gamma-induced protein 10 (IP-10), interleukin-8 (IL-8), epidermal tillväxtfaktor (EGF), matris metallopeptidas 9 (MMP-9), och interleukin-1 beta (IL-1β) . Utförandet av metoden initialt kontrolleras med hjälp av standardlösningar utgör rekombinanta analyt proteiner och blockeringsbuffert. Real salivprover från patienter med olika kroniska luftvägssjukdomar samt friska kontroller testades också med tillfredsställande resultat. Protokollet bör tillämpas på andra protein analyter och andra mikrosfärbaserade analyser. Denna plattform erbjuder avsevärda fördelar för analytisk kemi fält som det möjliggör snabb, noggrann och reproducerbar samtidig analys av låga koncentrationer av flera proteiner med ett brett dynamiskt omfång, minimala icke-specifika interaktioner, minskad provförbrukning, och låg kostnad i jämförelse med en analog enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. . Workflow för att anbringa fiberoptisk mikrosfär antikropp array till saliv profilering (1) Mikrosfärer är internt kodade med två fluorescerande färgämnen, (2) de kodade mikrosfärerna externt modifierad med proteinspecifika monoklonala antikroppar, (3) de multiplexerade mikrosfärema blandas, och (4) slumpmässigt deponerade i mikrobrunnar etsade vid den proximala änden av en fiberoptisk bunt, (5) salivproteiner fångas av mikrosfärer genom sandwich-immunanalys, och (6) kvantifierades med användning av fluorescensmikroskopi.
1. Mikrosfärer Kodning
- Väg natrium europium (III) thenoyltrifluoroacetonate trihydrat (Eu-TTA, MW = 869,54 g / mol) i en bärnstensfärgad glasflaska och bereda en 200 mM stamlösning i tetrahydrofuran (THF). Blanda försiktigt genom att pipettera, visuellt verifierafärgämnet är helt upplöst.
- Väg kumarin 30 (C30, molekylvikt = 347,41 g / mol) i en bärnstensfärgad glasflaska och framställa en 12 mM stamlösning i THF. Blanda försiktigt genom pipettering, visuellt kontrollera färgämnet är helt upplöst.
- Bered 700 | il arbetslösning för varje mikrosfär typ med användning av stamlösningar och THF för att nå en slutlig koncentration som anges i tabell 1.
- Se till mikrosfärer (10% vikt / volym) är väl upphängda genom skakning, och sedan överför 60 pl suspension till en 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Lägg till 600 l PBS till mikrosfärsuspensionen och blanda genom att pipettera 20x. Centrifugera röret vid 10.000 rpm under 3 min och noggrant avlägsna supernatanten. Upprepa denna process ytterligare 2x för att tvätta mikrosfärerna.
- Tvätta mikrosfärpellet 3x med THF med användning av en liknande procedur som i steg 1,5.
- Centrifugera mikrosfär / THF-suspensionen vid 10000 rpm under 3 min, avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 600 | ilArbetslösning listade i tabell 1. Överför blandningen till ett nytt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Täta mikrocentrifugrör med Parafilm och placera den på en shaker. Skaka vid 3000 rpm och inkubera i 24 timmar, skydda mot ljus genom att täcka installationen med hjälp av en låda täckt med aluminiumfolie.
- Centrifugera mikrosfärsuspension vid 10.000 rpm under 3 min för att bilda en pellet.
- Avlägsna supernatanten färgämneslösningen och tvätta mikrosfärerna 6x med 600 | il metanol och sedan med 600 | il PBS innehållande 0,01% Tween-20 annan 6x, såsom beskrivs i steg 1,5.
- Förvara de kodade mikrosfärer i 600 | il PBS innehållande 0,01% Tween-20 vid 4 ° C fram till användning, skyddas mot ljus.
| Mikrosfär typ namn: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
| Eu-TTA (mM) | 100 | 100 | 10 | 100 | 10 | ||
| C30 (mM) | 1 | 1 | 6 | 6 | 1 | 6 |
Tabell 1. Koncentrationerna av Eu-TTA och C30 arbetar lösningar.
2. Beredning av protein-capture mikrosfärer
- Förbered MES-buffert [2 - (N-morfolino) etansulfonsyra (MES) 0,1 M, NaCl 0,9%, SDS 0,01%, pH 5,7] och PBS / SDS-buffert (natriumfosfat 0,01 M, NaCl 0,154 M, SDS 0,01%, pH 7,4) i förväg vid rumstemperatur.
- Tillsätt 200 l kodade mikrosfärsuspensionen (innehållande ~ 2 mg mikrosfärer) till en Safe-Lock 1,5 ml mikrocentrifugrör. Det är viktigt att använda denna typ av mikrocentrifugrör för att undvika spill under inkubationen i steg 2,6. <li> Tvätta mikrosfärer med 600 pl MES buffert 3x som beskrivs i steg 1,5. Lägg till 700 pl MES till mikro pelleten och blanda väl genom att pipettera.
- Bered 0,105 g / ml 1-etyl-3-[3-dimetylaminopropyl] karbodiimid-hydroklorid (EDC, MW = 191,7 g / mol) och 0,163 g / ml sulfo-N-hydroxisulfosuccinimid (sulfo-NHS, MW = 217,13 g / mol) lösningar i MES-buffert i separata rör.
- Tillsätt 150 l nylagade EDC lösningen droppvis i mikrosfärsuspensionen. EDC hydrolyserar mycket snabbt, därför är det viktigt att använda nybakade lösning för att säkerställa immobilisering effektivitet. Omedelbart efter tillsatsen av EDC, tillsätt 150 | il sulfo-NHS-lösning till mikrosfärerna, blanda väl genom pipettering och kontrollera suspensionen är homogen.
- Cap röret, försegla den med Parafilm och placera den på en shaker. Skaka vid 1500 rpm under 4 h, skyddat från ljus med användning av en låda täckt med aluminiumfolie.
- Centrifugera mikrosfär Suspensjon vid 10.000 rpm under 3 min för att bilda en pellet och avlägsna supernatanten. Tvätta mikrosfärer med 500 | il PBS / SDS-buffert 3 gånger såsom beskrivits i steg 1,5.
- Tillsätt 200 l PBS / SDS-buffert till pelleten, blanda mikrosfärerna väl och överför lösningen till 300 l PBS / SDS-buffert innehållande 60 mikrogram fånga antikroppar. Det är viktigt att avbryta mikro pellets först och sedan lägga till mikrosfärsuspensionen i antikroppslösningen.
- Inkubera antikropp-mikrosfärer blandning genom skakning vid 1500 rpm i 4 timmar på en shaker, skydda mot ljus med hjälp av en låda täckt med aluminiumfolie.
- Centrifugera mikrosfärsuspension vid 10.000 rpm under 3 min för att bilda en pellet och avlägsna supernatanten. Tvätta mikrosfärer med 500 | il StartingBlock (TBS) blockerande buffert 3x, såsom beskrivs i steg 1,5.
- Blanda mikrosfärer med 1 ml TBS-blockeringsbuffert och inkubera mikrosfärer vid 1500 rpm under 1 timme på en skakapparat, skyddat från ljus med användning av en låda coveröd med aluminiumfolie.
- Centrifugera mikrosfärsuspension vid 7000 varv per minut under 3 minuter för att bilda en pellet och avlägsna supernatanten. Tvätta pelleten 3x med 500 ^ il TBS-blockeringsbuffert, som beskrivs i steg 1,5.
- Centrifugera mikrosfären lösningen vid 7000 rpm under 3 min för att bilda en pellet och avlägsna supernatanten. Tillsätt 500 l TBS blockerande buffert och blanda genom att pipettera.
- Förvara den modifierade mikrosfär suspensionen vid 4 ° C fram till användning, skyddas mot ljus.
- Upprepa proceduren för att göra andra typer av mikrosfärer med hjälp av motsvarande antikroppar.
3. Fiberoptisk Microarray Assembly
- Blanda 50 pl av varje typ av protein-infångningsmikrosfärer till ett nytt autoklaverat mikrocentrifugrör. Centrifugera aktiemikrosfärer pool vid 7000 rpm i 3 minuter och avlägsna supernatanten så att den återstående volymen är cirka 100 ^.
- Hand-cut fiberoptiska knippen till cirka 5 cm i längd ochsekventiellt polera båda ändarna på en polermaskin med hjälp av 30, 15, 9, 6, 3, 1, 0,5 och 0,05 ìm stora diamant lappande filmer. Sonikera polerad knippet i avjoniserat vatten i 2 min för att avlägsna eventuella partiklar.
- Sätt en liten magnetisk omrörarstav i ett 0,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 400 | il av proteinfritt PBS-buffert och rör om på en magnetisk omrörningsplatta under 30 minuter för att avlägsna luftbubblor.
- Etsa en ände av den polerade fiberknippet i en 0,025 N HCl-lösning under 150 sek 10,16. Omedelbart dränka och sonikera den etsade änden i avjoniserat vatten under 1 min. Torka fiberknippena med tryckluft.
- Montera fiberknippe på en fiberhållare och blockera etsas ände i bubbelfritt, proteinfritt PBS-buffert under 1 timme.
- Insättning 1 ul alikvot av den lagrade mikrosfärsuspension på den etsade änden av den fiberoptiska bunten. Skydda installations från ljus med en låda med aluminiumfolie, och vänta 15 min. Volymen av suspensionen kommerminska genom indunstning och tvinga mikrosfärerna in i de etsade mikrobrunnarna. Upprepa denna laddningssteg en gång till.
- Använd en bomullstopp mättad med provlösningen för att avlägsna mikrosfärer som inte är fast i mikrobrunnarna. Proteinmicroarray är nu klar att användas. Gå direkt till steg 4.1 för salivanalys.
4. Salivprov analys med mikrosfärer microarray
- Addera 200 pl provlösning (100 | il saliv supernatanten späddes med lika stor volym av StartingBlock T20 (PBS) blockeringsbuffert. Samlingen protokoll för saliv supernatant som tidigare publicerats 10). in i en 0,5 ml autoklaver mikrocentrifugrör. Doppa proteinmicroarray lastas på fibern i lösningen och inkubera på skak vid 600 rpm i 2 h, skydda mot ljus med hjälp av en låda täckt med aluminiumfolie.
- Bered 20 ml tvättbuffert genom tillsats av 200 pl 10% BSA-lösning och 200 | il 10% Tween-20 i 19,6 ml PBS, mix väl genom att försiktigt skaka.
- Doppa proteinmikroarray till ett nytt autoklaverat mikrocentrifugrör innehållande 200 | il tvättbuffert och skaka vid 600 rpm under 2 min. Upprepa tvätt 3x.
- Inkubera mikromatrisen i 100 | il lösning av en detektionsantikropp cocktail innehållande 5 pg / ml av anti-VEGF-, IP-10, IL-8, EGF, MMP-9, IL-1β biotinylerade detektionsantikroppar i StartingBlock T20 (PBS) blockeringsbuffert under 30 minuter vid rumstemperatur på en skakapparat vid 600 rpm, skyddas mot ljus med användning av en låda täckt med aluminiumfolie.
- Tvätta microarray 3x med tvättbuffert såsom beskrivs i steg 4,3.
- Inkubera microarray i 200 l av 20 mikrogram / ml streptavidin R-fykoerytrin-konjugat (SAPE) lösning i PBS vid 600 rpm på skak under 10 minuter, skydda mot ljus med hjälp av en låda täckt med aluminiumfolie.
- Tvätta microarray 5x med tvättbuffert såsom beskrivs i steg 4,3.
- Rengör den distala änden av fibern (dvs slutet bortfrån mikrosfärerna) bunt med en svabb mättad med absolut etanol.
- Torka båda ändarna av fibern med tryckluft. Montera fiber på ett epifluorescent mikroskop och bilden genom den distala änden av fibern.
- Förvärva mikrosfär bilder som motsvarar Eu-TTA, C30, och SAPE fluorescens utsläppsintensitet. Optiska filter inställning och exponeringstider för fluorescens avbildning av Eu-TTA, C30, och SAPE visas i tabell 2.
| Kanal | Eu-TTA | C30 | SAPE |
| Exciter | 365/10x | 350/50x | 546/10x |
| Stråldelaren | 525DCLP | 400DCLP | 560LP |
| Emitter | 620/60m | 460/50m | 580/30m |
| Exponeringstid | 1 sek | 0,3 sek | 1 sek |
Tabell 2. Parametrar för de tre fluorescerande bilder av microarray.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fluorescensbilder från tre kanaler som visar en liten del av den fiberoptiska bunten är visade i figurerna 2A-C. Dessa bilder analyserades genom användning av en algoritm skriven i MATLAB (såsom beskrivs mer i detalj i den diskussion avsnitt). Analysen använder såväl information från Eu-TTA-kodning bilden (Figur 2A) och C30-kodning bilden (Figur 2B) för att avkoda mikrosfärer, och fluorescensintensiteterna av olika mikrosfärer i signalbild (figur 2C) beräknades. Med kalibreringskurvorna som erhållits från korrelerade proteinstandarder, var koncentrationen av proteiner i salivprover beräknas.
Figur 2. (A) Eu-TTA-kodning bilden, (B) C30-kodning bild, (C) SAPE signalbild, (D) avkodning resultats överlappad på signalbilden; olika typer av mikrosfärer märkta med olika färger och former.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forskare bör ägna extra uppmärksamhet åt följande åtgärder: bättre avkodning noggrannhet är det nödvändigt att kontrollera de mikrosfärerna suspenderades homogent i alla inkubation och tvätta steg under mikrosfärer kodningsförfarandet. Dessutom, de kodade mikrosfärerna måste skyddas från ljus under hela experimentet. Efter korrekt kodning och lagringsförfaranden, fann vi att den totala avkodning noggrannhet var över 99%. De kodade mikrosfärer bör förvaras vid 4 ° C. Undvik frysning och skydda den mot ljus. Under förvaringsvillkoren, de kodade mikrosfärerna är stabila i mer än sex månader. Extrem försiktighet krävs under kodnings-och modifierings åtgärder för att minska förlusten av mikrosfärer. Till exempel inte störa mikro pellets när du tar bort supernatanten. Dessutom inbegripet Tween-20 och SDS i buffertarna är avgörande för en bättre mikrosfär pelletering.
Vissa of de gemensamma felsökning är: (1) endast använda nygjord EDC-lösning och EDC-lösningen tillsättas droppvis, (2) autoklaveras rör bör användas och mikrosfärlösningen bör överföras till ett nytt rör före varje inkubationssteg, ( 3) under varje tvättsteg, försök att avlägsna supernatanten så mycket som möjligt, (4) de modifierade mikrosfärerna ska förvaras vid 4 ° C, undvika frysning och skydda den mot ljus. Under korrekta förvaringsförhållanden, kan de modifierade mikrosfärerna lagras för mer än 3 månader utan detekterbar signalförlust.
MATLAB algoritm som används för att analysera fluorescensbilder beskrivs kortfattat nedan. Den aktuella koden finns i kompletterande material. Pixlar inom en användardefinierad intensitetsintervallet för Eu-TTA bilden filtreras först. Olika områden som kontrollerades med en storlek-filter, områden som innehåller en "ihålig" center som orsakats av ljusdämpning togs bort och områden därmikrosfärer är närvarande sorterades in i en bevakningslista för framtida bearbetning. Alla mikrosfärer från bevakningslistan var ytterligare filtreras med svar i motsvarande C30 bilden. Signalerna för alla pixlar i en viss mikrosfär beräknades. Signalstyrkan för detta mikrosfär av intresse beräknades genom medelvärdesbildning av intensiteterna för alla mikrosfärer i bevakningslista. För att göra resultaten statistiskt mer representativ, har minst 25 mikrosfärer av varje typ som krävs. För att minimera den icke-specifika signalen och minska variationen mellan olika experiment signaler för alla mikrosfärtyper normaliseras genom att subtrahera signalen från kontrollmikrosfärer.
Den signal som gensvar av mikrosfärerna kan justeras genom mängden antikroppar immobiliseras på ytan av mikrosfärer, som är idealisk för multiplexerad detektion av proteiner med brett intervall av koncentrationer. Baserat på olika diametrarna hos mikrosfärerna, than mängd antikropp som krävs för att bilda ett monoskikt på mikrosfärerna kan beräknas genom ekvationen från tillverkaren 17. För mikrosfärer med en diameter av 4,5 ^ m, 3 pg av antikropp behövs per 1 mg av mikrosfärer. Vi har testat olika mängder antikroppar i kopplingslösningen i steg 2.8 från 3 mikrogram (0,5 X) till 60 mikrogram (10x) av antikroppar. Ökade signaler observerades när mer antikropp användes i lösningen. Optimala mängder antikroppar för olika antikroppar och applikationer skall experimentellt bestämmas. De "kontrollmikrosfärer" kopplades med musen isotyp IgG-antikropp, som levereras av tillverkaren som den negativa kontrollen i direkt ELISA och har inte visat någon korsreaktivitet med upp till 40 rekombinanta humana proteiner 18. För att utvärdera reproducerbarheten hos kopplingsmetoden har två satser av MMP-9 mikrosfärer kopplade på olika dagar. Prestandan hos mikrosfärerna testades genom användning av multiplexed detektion av 10 ng / ml, MMP-9. Resultaten visade inte några signifikanta skillnader mellan olika satser av mikrosfärer (detaljerade resultaten visas i tabell 3).
| Ingen | Datum | Test 1 | Test 2 | Test 3 | Genomsnitt | Std |
| 1 | 2011/01/12 | 773,8 | 690,1 | 756,8 | 740,2 | 44,2 |
| 2 | 2011/01/26 | 791,9 | 721,8 | 867,0 | 793,6 | 72,6 |
Tabell 3. Reproducerbarheten av de kopplingsmetoder (resultaten visas i godtyckliga enheter).
Den multiplex metod som presenteras här möjliggör snabb, noggrann och reproducerbaranalys av olika proteiner över ett brett koncentrationsområde (resultat uppräknade i Tabell 4). Den potentiella korsreaktivitet för sex par antikropps vi använde i denna studie testades också. Alla signaler från korsreaktivitet befanns vara försumbar (mindre än 3%). Andra fördelar med denna metod, jämfört med en konventionell enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA), innefattar ett brett dynamiskt intervall, minimala icke-specifika interaktioner, reducerade provet förbrukning och låg kostnad 10. Den erfordrade volymen av salivprov är så låg som 100 | il och analysen kan avslutas inom 3,5 timmar. Jämfört med andra upphängnings arrayer, är en begränsning av detta tillvägagångssätt att när microarray monterades behöver upptäckten startas på mindre än 15 minuter. Den metod som beskrivs här har använts i vårt laboratorium för att analysera mänskliga salivprover som samlats in från patienter med inflammatoriska sjukdomar och friska kontroller (opublicerade data). Metoden bör vara tillämpligför proteinanalys av andra komplexa fluidprover. En liknande mikrosfärbaserat protein array kan användas på andra plattformar såsom mikroflödessystem enheter. Kodningen och immobiliserade metoder kan också tillämpas för att mikrosfärer framställda med andra material 9.
| VEGF | IP-10 | IL-8 | EGF | MMP-9 | IL-1β | |
| Test 1 | 5365,9 | 2578,4 | 6508,7 | 2584,0 | 515,5 | 1147,4 |
| Test 2 | 5787,8 | 2577,9 | 7238,9 | 2919,2 | 375,7 | 1099,2 |
| Test 3 | 4944,6 | 2883,3 | 6726,3 | 3619,3 | 406,8 | 1084,1 |
| Genomsnitt | 5366,1 | 2679,9 | 6824,6 | 3040,8 | 432,7 | 1110,2 |
| Std. Dev | 421,6 | 176,2 | 374,9 | 528,3 | 73,4 | 33,1 |
Tabell 4. Resultat för de tre oberoende tester på samma salivprov (resultaten visas i godtyckliga enheter).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (bidrags 08UDE017788-05). EBP erkänner också stöd från den spanska stiftelsen för vetenskap och teknik (FECYT). Författarna tackar Shonda T. Gaylord och Pratyusha Mogalisetti för kritisk läsning av manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Eu-TTA dye | Fisher Scientific | AC42319-0010 | |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865-100ML | |
| Amber glass vial | Fisher Scientific | 03-339-23B | |
| Coumarin 30 dye | Sigma-Aldrich | 546127-100MG | |
| Microspheres | Bangslabs | PC05N/6698 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| PBS 10x concentrate | Sigma-Aldrich | P5493-1L | |
| Water | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-100ML | |
| Tw-20 | Sigma-Aldrich | P7949-100 ml | |
| BupH MES buffered saline | Thermo Scientific | 28390 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | 05030-500ML-F | |
| NaOH solution | Fisher Scientific | SS256-500 | |
| Safe-lock microcentrifuge tube | VWR labshop | 53511-997 | |
| EDC | Thermo Scientific | 22980 | |
| Sulfo-NHS | Thermo Scientific | 24510 | |
| Human VEGF capture antibody | R&D Systems | MAB293 | |
| Human IP-10 capture antibody | R&D Systems | MAB266 | |
| Human IL-8 capture antibody | R&D Systems | MAB208 | |
| Human EGF capture antibody | R&D Systems | MAB636 | |
| Human MMP-9 capture antibody | R&D Systems | MAB936 | |
| Human IL-1β capture antibody | R&D Systems | MAB601 | |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | R&D Systems | MAB002 | |
| StartingBlock (TBS) buffer | Thermo Scientific | 37542 | |
| HCl standard solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | 318949-500 ml | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Protein-free (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37572 | |
| Recombinant human VEGF 165 | R&D Systems | 293-VE | |
| Recombinant human IP-10 | R&D Systems | 266-IP | |
| Recombinant human IL-8 | R&D Systems | 208-IL | |
| Recombinant human EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| Recombinant human MMP-9 | R&D Systems | 911-MP | |
| Recombinant human IL-1β | R&D Systems | 201-LB | |
| StartingBlock T20 (PBS) buffer | Thermo Scientific | 37539 | |
| Blocker BSA in PBS | Thermo Scientific | 37525 | |
| Biotinylated VEGF detection antibody | R&D Systems | BAF293 | |
| Biotinylated IP-10 detection antibody | R&D Systems | BAF266 | |
| Biotinylated IL-8 detection antibody | R&D Systems | BAF208 | |
| Biotinylated EGF detection antibody | R&D Systems | BAF236 | |
| Biotinylated MMP-9 detection antibody | R&D Systems | BAF911 | |
| Biotinylated IL-1β detection antibody | R&D Systems | BAF201 | |
| Streptavidin, R-phycoerythrin | Invitrogen | S-21388 | |
| Ethanol (200 proof) | Sigma-Aldrich | E7023-500ML |
References
- Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., Brown, P. O. Quantitative monitoring of gene-expression patterns with a complementary-DNA microarray. Science. 270, 467-470 (1995).
- Schena, M. Protein Microarray. , Jones and Bartlett Publishers. (2004).
- Tam, S. W., Wiese, R., Lee, S., Gilmore, J., Kumble, K. D. Simultaneous analysis of eight human Th1/Th2 cytokines using microarrays. J. Immunol. Methods. 261 (01), 157-165 (2002).
- Wang, C. C., et al. Array-based multiplexed screening and quantitation of human cytokines and chemokines. J. Proteome Res. 1, 337-343 (2002).
- de Jager, W., Velthuis, te, Prakken, H., Kuis, B. J., W,, Rijkers, G. T. Simultaneous detection of 15 human cytokines in a single sample of stimulated peripheral blood mononuclear cells. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10, 133-139 (2003).
- Lee, H. J., Nedelkov, D., Corn, R. M. Surface plasmon resonance imaging measurements of antibody arrays for the multiplexed detection of low molecular weight protein biomarkers. Anal. Chem. 78, 6504-6510 (2006).
- Vignali, D. A. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J. Immunol. Methods. 243 (00), 243-255 (2000).
- Rissin, D. M., et al. Single-molecule enzyme-linked immunosorbent assay detects serum proteins at subfemtomolar concentrations. Nat. Biotechnol. 28, 595-599 (2010).
- Zhang, H., Nie, S., Etson, C. M., Wang, R. M., Walt, D. R. Oil-sealed femtoliter fiber-optic arrays for single molecule analysis. Lab Chip. 12, 2229-2239 (2012).
- Blicharz, T. M., et al. Fiber-Optic Microsphere-Based Antibody Array for the Analysis of Inflammatory Cytokines in Saliva. Anal. Chem. 81, 2106-2114 (2009).
- Mukhopadhyay, R.
- Wong, D. T. Salivary diagnostics powered by nanotechnologies, proteomics and genomics. J. Am. Dent. Assoc. 137, 313-321 (2006).
- Segal, A., Wong, D. T. Salivary diagnostics: enhancing disease detection and making medicine better. Eur. J. Dent. Educ. 12, 22-29 (2008).
- St John, M. A. R., et al. Interleukin 6 and interleukin 8 as potential biomarkers for oral cavity and oropharyngeal squamous cell carcinoma. Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 130, 929-935 (2004).
- Herr, A. E., et al. Microfluidic immunoassays as rapid saliva-based clinical diagnostics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5268-5273 (2007).
- Pantano, P., Walt, D. R.
- Schena, M. Protein Microarrays. , Jones and Bartlett Publishers. (2005).
- Mouse IgG1 Isotype Control [Internet]. , Available from: http://www.rndsystems.com/Products/MAB002 (2013).
