الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من الخلايا العصبية الحصين الابتدائية
Summary
هطول فوسفات الكالسيوم هو وسيلة مريحة واقتصادية لترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة. مع التحسين، وأنه من الممكن استخدام هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب بالنقل مثل الخلايا العصبية الأولية. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون cocultured مع الخلايا astroglial.
Abstract
هطول فوسفات الكالسيوم هو وسيلة مريحة واقتصادية لترنسفكأيشن من الخلايا المستزرعة. مع التحسين، وأنه من الممكن استخدام هذه الطريقة على الخلايا التي يصعب بالنقل مثل الخلايا العصبية الأولية. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون cocultured مع الخلايا astroglial.
Introduction
الخلايا العصبية الأولية هي واحدة من أصعب أنواع الخلايا لبالنقل كما هي تالية للتفتل وحساسة جدا للتغيرات البيئية الصغرى. هناك أربعة أنواع شائعة الاستخدام من أساليب التعبير عن الجينات خارجية والرنا دبوس الشعر القصير (shRNAs) في هذه الخلايا 1. لكل منها مزاياه وعيوبه. على سبيل المثال، عادة ما يتم إجراء التثقيب الكهربائي في الخلايا العصبية معزولة طازجة 2، كما يجب أن يتم نقل الخلايا في cuvettes لترنسفكأيشن. يمكن أن عدوى فيروس عادة تحقيق كفاءة عالية جدا 3، ولكنه أكثر ومحفوفة بالمخاطر بالنسبة للمشغلين كثيفة العمالة. العديد من الكواشف ترنسفكأيشن بوساطة الدهون المتاحة تجاريا، بدرجات متفاوتة من النجاح في الخلايا العصبية ومستويات مختلفة من السمية الخلوية.
ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم يمثل طريقة مريحة واقتصادية لإدخال الجينات الغريبة إلى الخلايا العصبية. كان يستخدم الأسلوب الأول لإدخال الحمض النووي اتش سل في الثديياتليرة سورية من قبل غراهام وفان دير إب (1973) 4. تم إجراء ترنسفكأيشن عن طريق خلط كلوريد الكالسيوم مع الحمض النووي المؤتلف في العازلة الفوسفات. وهذا يسمح للتشكيل الفوسفات الحمض النووي / يترسب الكالسيوم والتي، عندما انخفض تدريجيا على أحادي الطبقة من الخلايا، والتمسك سطح الخلية، ويتم تناولها من قبل الإلتقام و اخيرا يدخل في النواة 5. ومن شأن هذه العملية تؤدي إلى التعبير عن الجينات الغريبة التي أدخلت في الخلية المستهدفة. الكفاءة نموذجية من مجموعة فوسفات الكالسيوم ترنسفكأيشن بين 0،5-5٪ 6-8. ومع ذلك، مع الحرص على التحسين والتنفيذ المتسق للبروتوكول تجريبي، فمن الممكن للوصول إلى الكفاءة ترنسفكأيشن ما يقرب من 50٪. نحن هنا وصف بروتوكول مفصلة لدينا ترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم من الخلايا العصبية قرن آمون الأولية، التي cocultured مع الخلايا astroglial في شكل شطيرة 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
وهناك العديد من المعايير الأساسية التي يجب أن تسيطر عليها بعناية لtransfections ناجحة على الدوام 10،11. المعلمة الأكثر أهمية بالنسبة لترنسفكأيشن فوسفات الكالسيوم هي قيمة الرقم الهيدروجيني لل2X HBS، والتي تختلف في أيدينا عادة ما بين 7،10-7،15. نوصي جعل ثلاث دفعات من الأسهم م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح NS065183 وأموال بدء من كلية روتجرز روبرت وود جونسون الطبية.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
