סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס
Summary
המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.
Abstract
המשקעים סידן פוספט הוא שיטה נוחה וחסכונית עבור transfection של תאים בתרבית. עם אופטימיזציה, ניתן להשתמש בשיטה זו בתאים שקשה transfect כמו נוירונים עיקרי. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס cocultured עם תאי astroglial.
Introduction
הנוירונים עיקריים הם אחד מסוגי התאים בצורה הקשה ביותר לtransfect כפי שהם postmitotic ורגישים מאוד לשינויי מיקרו סביבתיים. ישנם ארבעה סוגים נפוצים של שיטות לביטוי של גנים אקסוגניים וRNAs קצר סיכה (shRNAs) בתאים אלה 1. לכל אחד יש יתרונות משלה וחסרונות. לדוגמא, electroporation מבוצע בדרך כלל על נוירונים מבודדים טרי 2, כמו תאים חייבים להיות מועברים לcuvettes עבור transfection. זיהום בנגיף בדרך כלל ניתן להשיג יעילות גבוהה מאוד 3, אבל הוא יותר עתיר עבודה ומסוכנת למפעילים. ריאגנטים transfection בתיווך שומנים רבים זמינים באופן מסחרי, בדרגות שונות של הצלחה בתאי עצב ורמות שונות של cytotoxicity.
transfection סידן פוספט מייצג שיטה נוחה וחסכונית להחדרת גנים זרים לתוך תאי עצב. השיטה שימשה לראשונה להציג את ה-DNA adenovirus לתוך cel היונקיםls ידי גרהם ואן דר Eb (1973) 4. Transfection בוצע על ידי ערבוב של סידן כלורי עם ה-DNA רקומביננטי בחיץ פוספט. זה מאפשר היווצרות של פוספט DNA / סידן שוקע בו, כאשר ירד בהדרגה על monolayer של תאים, לדבוק בתא השטח, נתפס על ידי אנדוציטוזה וסופו של דבר להיכנס לגרעין 5. תהליך זה יביא לביטוי של גנים זרים הציגו בתא היעד. יעילות אופיינית למגוון transfection סידן פוספט בין 0.5-5% 6-8. עם זאת, עם אופטימיזציה מדוקדקת וביצוע של פרוטוקול הניסוי עולה בקנה אחד, אפשר להגיע ליעילות transfection של כמעט 50%. כאן אנו מתארים הפרוטוקול מפורט שלנו עבור transfection סידן פוספט של נוירונים בהיפוקמפוס עיקריים, אשר cocultured עם תאי astroglial בפורמט כריך 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר פרמטרים מרכזיים שצריך להיות מבוקרים בקפידה לtransfections המוצלח באופן עקבי 10,11. הפרמטר הקריטי ביותר עבור transfection סידן פוספט הוא ערך ה-pH של 2x HBS, אשר בידיים שלנו בדרך כלל נע בין 7.10-7.15. אנו ממליצים להכין שלוש קבוצות של מניות עם ערכי ה-pH ב0.05 מרווחים כדי להסביר את ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH המענק NS065183 וקרנות הזנק מבית הספר לרפואת ראטגרס רוברט ווד ג'ונסון.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
