प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक
Summary
कैल्शियम फॉस्फेट तेज़ी संवर्धित कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए एक सुविधाजनक और किफायती तरीका है. अनुकूलन के साथ, यह प्राथमिक न्यूरॉन्स की तरह मुश्किल से transfect कोशिकाओं पर इस विधि का उपयोग करने के लिए संभव है. यहाँ हम astroglial कोशिकाओं के साथ cocultured hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Abstract
कैल्शियम फॉस्फेट तेज़ी संवर्धित कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए एक सुविधाजनक और किफायती तरीका है. अनुकूलन के साथ, यह प्राथमिक न्यूरॉन्स की तरह मुश्किल से transfect कोशिकाओं पर इस विधि का उपयोग करने के लिए संभव है. यहाँ हम astroglial कोशिकाओं के साथ cocultured hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Introduction
प्राथमिक न्यूरॉन्स वे postmitotic हैं और सूक्ष्म पर्यावरण परिवर्तन के प्रति बहुत संवेदनशील हैं के रूप में transfect करने के लिए सबसे कठिन प्रकार की कोशिकाओं में से एक हैं. इन कोशिकाओं 1 में एक्सोजेनस जीन और लघु बाल के लिये कांटा RNAs (shRNAs) की अभिव्यक्ति के लिए तरीकों की चार आमतौर पर इस्तेमाल किया प्रकार के होते हैं. प्रत्येक के अपने फायदे और नुकसान है. कोशिकाओं अभिकर्मक के लिए cuvettes में स्थानांतरित किया जाना चाहिए के रूप में उदाहरण के लिए, electroporation आमतौर पर, हौसले से अलग न्यूरॉन्स 2 पर किया जाता है. वायरस संक्रमण आमतौर पर बहुत उच्च क्षमता 3 को प्राप्त है, लेकिन अधिक श्रम प्रधान ऑपरेटरों के लिए और जोखिम भरा है सकते हैं. कई लिपिड की मध्यस्थता अभिकर्मक अभिकर्मकों न्यूरॉन्स और cytotoxicity के विभिन्न स्तरों में सफलता की डिग्री बदलती के साथ, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं.
कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक न्यूरॉन्स में विदेशी जीन शुरू करने के लिए एक सुविधाजनक और किफायती तरीका का प्रतिनिधित्व करता है. विधि प्रथम स्तनधारी सेल में adenovirus डीएनए को पेश किया गया थाग्राहम और वान डेर EB (1973) द्वारा लोकसभा 4. अभिकर्मक एक फॉस्फेट बफर में पुनः संयोजक डीएनए के साथ कैल्शियम क्लोराइड मिश्रण द्वारा किया गया था. यह धीरे – धीरे कोशिकाओं की एक monolayer पर गिरा जब डीएनए / कैल्शियम फॉस्फेट के गठन कोशिका की सतह का पालन करना, endocytosis द्वारा हाथ में लिया और अंत में नाभिक 5 में प्रवेश कर रहे हैं, जो precipitates की अनुमति देता है. इस प्रक्रिया लक्ष्य कक्ष में पेश विदेशी जीनों की अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व करेंगे. 0.5-5% 6-8 के बीच कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक श्रृंखला की विशिष्ट क्षमता. हालांकि, सावधान अनुकूलन और प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल के अनुरूप निष्पादन के साथ, यह लगभग 50% की एक अभिकर्मक दक्षता तक पहुँचने के लिए संभव है. यहाँ हम एक सैंडविच प्रारूप 9 में astroglial कोशिकाओं के साथ cocultured रहे हैं जो प्राथमिक hippocampal न्यूरॉन्स की कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए हमारे विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.
Protocol
Representative Results
Discussion
ध्यान से लगातार सफल transfections 10,11 के लिए नियंत्रित करने की आवश्यकता है कि कई महत्वपूर्ण पैरामीटर शामिल हैं. कैल्शियम फॉस्फेट अभिकर्मक के लिए सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर हमारे हाथ में आमतौर पर 7.10-7.15 के बीच ह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच अनुदान NS065183 और रटगर्स रॉबर्ट वुड जॉनसन मेडिकल स्कूल से शुरू हुआ धन के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | straight / sharp 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger spring scissors | Fine Science Tools | 15008-08 | angled / sharp / 8.5 cm / 5 mm cutting edge |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91401-14 | blunt / 14.5 cm |
| Spring scissors | Fine Science Tools | 15006-09 | angled to side / 9 cm / 10 mm cutting edge |
| Isoflurane | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P2636 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| 100 mM Sodium pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal Media | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 Supplement (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 Supplement | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% Trypsin | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| Cytosine arabinoside | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| Kynurenic acid | Sigma | K3375 |
References
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M., Banker, G. a. G. K. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11 (2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G., Banker, G. a. G. K. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. , (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
