Isolatie, Cultuur en Transplantatie van Muscle satelliet-cellen
Summary
De isolatie en cultuur van een zuivere populatie van rustende cellen satelliet, een spier stamcelpopulatie, is essentieel voor het begrip van spier stamcel biologie en regeneratie, en stamceltransplantatie voor therapieën spierdystrofie en andere degeneratieve ziekten.
Abstract
Spier satelliet-cellen zijn een stamcel populatie vereist voor postnatale skeletspieren ontwikkeling en regeneratie, goed voor 2-5% van sublaminal kernen in spiervezels. Bij volwassen spier-, satelliet-cellen zijn normaal mitotically rust. Na verwonding echter satellietcellen initiëren cellulaire proliferatie myoblasten, hun nakomelingen, de regeneratie van spieren te produceren mediëren. Transplantatie van satelliet-cel afgeleide myoblasten is vaak bestudeerd als mogelijke therapie voor verschillende ziekten waaronder regeneratieve spierdystrofie, hartfalen en urologische stoornissen. Myoblast transplantatie in dystrofe skeletspieren, infarct hart, en disfunctioneren urinewegen heeft aangetoond dat geënt myoblasts kunnen differentiëren in spiervezels in de ontvangende weefsels en tonen gedeeltelijke functionele verbetering bij deze ziekten. Daarom is de ontwikkeling van efficiënte zuiveringswerkwijzen van rustende cellen van satelliet skelet muscle, alsmede de per satelliet cel afkomstige myoblasten culturen en transplantatie werkwijzen voor myoblasten, essentieel voor het begrijpen van de moleculaire mechanismen achter Sat cel zelf-vernieuwing, activatie en differentiatie. Bovendien, de ontwikkeling van cel-gebaseerde therapieën voor spierdystrofie en andere regeneratieve ziekten zijn ook afhankelijk van deze factoren.
De huidige potentiële zuiveringswerkwijzen van latente satelliet cellen vereisen het gebruik van dure fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) machines. Hier presenteren we een nieuwe methode voor de snelle, zuinige en betrouwbare zuivering van latente satelliet cellen uit volwassen muis skeletspier door enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische-geactiveerde cel sortering (MACS). Na isolatie van zuivere rustende satelliet cellen kunnen deze cellen worden gekweekt om grote aantallen myoblasten vinden na een aantal passages. Deze vers geïsoleerderustende satelliet cellen of ex vivo geëxpandeerde myoblasten kunnen getransplanteerd worden in cardiotoxine (CTX) geïnduceerde regeneratie muis skeletspieren de bijdrage van donor afgeleide cellen onderzoeken in regenererende spiervezels, alsmede satelliet cel compartimenten voor het onderzoek van zelfvernieuwing activiteiten.
Introduction
Spier satelliet cellen zijn een kleine populatie van myogene stamcellen zich onder de basale lamina van spiervezels. Ze worden gekenmerkt door de expressie van PAX7, Pax3, c-Met, M-cadherine, CD34, Syndecan-3 en calcitonine 1 – 3. Satelliet cellen bewezen belast spierregeneratie spier stamcellen zijn. Bij volwassen spier-, satelliet-cellen zijn normaal mitotically rust 4-8. Na letsel, zijn satelliet-cellen geactiveerd, initiëren uitdrukking van MyoD, en voer de celcyclus aan hun nageslacht uit te breiden, genoemd myogene voorloper cellen of myoblasts 3. Na verscheidene celdeling, myoblasten verlaat de celcyclus en de zekering elkaar om differentiatie te ondergaan in meerdere kernen myotubes, gevolgd door volwassen spiervezels. Myoblasten geïsoleerd uit volwassen spier kan gemakkelijk worden uitgebreid ex vivo. De capaciteit van myoblasten tot spiervezels in regenererende spieren envorm buitenbaarmoederlijke spiervezels in nonmuscle weefsels wordt uitgebuit door myoblast transplantatie, een mogelijke therapeutische benadering voor Duchenne spierdystrofie (DMD) 4, urologische dysfunctie 9, en hartfalen 10. Inderdaad, myoblasten met succes getransplanteerd in de spier van zowel mdx (DMD model) muizen en DMD patiënten 11-14. De geïnjecteerde normale myoblasten fuseren met gastheer spiervezels de histologie en functie van de aangetaste spieren verbeteren. Vorige werk aangetoond dat subpopulaties van myoblasts meer zijn stamcel-achtige en blijven in een ongedifferentieerde staat langer in de spieren tijdens spierregeneratie 5. Recent onderzoek heeft aangetoond dat vers geïsoleerde satelliet-cellen uit volwassen spier bevatten een stamcel-achtige bevolking die efficiënter innesteling en zelfvernieuwing activiteit in regenererende spieren 5-8 vertoont. Daarom zuivering van een zuivere populatie van latente satelliet cellen van het skelet mu volwassenSCLE is essentieel voor het begrip van de biologie van satelliet-cellen, myoblasts en spierregeneratie, en voor de ontwikkeling van cel-gebaseerde therapieën.
De huidige potentiële zuiveringswerkwijzen van latente satelliet cellen vereisen het gebruik van een duur-fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) machine 1,2,6-8. Bovendien FACS laserbelichting neiging celdood bij scheiding, waarbij lagere opbrengst van latente satelliet-cellen 15 veroorzaakt induceren. Hier presenteren we een nieuwe methode voor de snelle, zuinige en betrouwbare zuivering van latente satelliet cellen uit volwassen muis skeletspieren. Deze werkwijze gebruikt enzymatische dissociatie gevolgd door magnetische-geactiveerde celsortering (MACS). Na isolatie van zuivere rustende satelliet cellen kunnen deze cellen worden gekweekt om grote aantallen myoblasten vinden na een aantal passages. We tonen ook aan dat intramusculaire injectie van deze vers geïsoleerde rustende satelliet cellen of ex vivo geëxpandeerde myoblasten kunnen worden getransplanteerd in cardiotoxine (CTX) geïnduceerde regeneratie muis skeletspieren de bijdrage van donor afgeleide cellen te regenereren spiervezels, alsmede satelliet cel compartimenten voor het onderzoek van zelfvernieuwing-activiteiten.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol kan rustende satellietcellen gemakkelijk worden gezuiverd uit volwassen skeletspier van muizen door collagenase digestie en oppervlakte-antilichaam-gemedieerde MACS scheiding. Deze methode duurt ongeveer 6 uur en geen dure apparatuur zoals een FACS-machine. Daarnaast is deze methode is relatief goedkoop in vergelijking met oppervlakte-antilichaam-gemedieerde FACS scheiding. Een hogere opbrengst van latente satelliet-cellen wordt ook verwacht in vergelijking met FACS voor deze methode omdat FACS laserbeli…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken dr. Shahragim Tajbakhsh voor het verstrekken Myf5 + / nLacZ muizen. We danken ook Alexander Hron en Michael Baumrucker voor het kritisch lezen van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Vereniging van de Spierdystrofie (MDA) en Gregory Marzolf Jr MD Center Award.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
Referências
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
