筋衛星細胞の単離、培養、および移植
Summary
静止衛星細胞の純粋な集団の単離および培養、筋肉幹細胞集団は、筋肉幹細胞生物学および再生、ならびに筋ジストロフィーおよび他の変性疾患における治療のための幹細胞移植の理解に不可欠である。
Abstract
筋衛星細胞は、筋線維におけるsublaminal核の2〜5％を占め、出生後の骨格筋の発達と再生に必要な幹細胞集団である。大人の筋肉では、衛星細胞は通常、有糸分裂的に静止状態にある。損傷後、しかしながら、衛星細胞、筋肉の再生を媒介する筋芽細胞、それらの子孫を生成するために細胞増殖を開始する。衛星細胞由来の筋芽細胞の移植が広く筋ジストロフィー、心不全、および泌尿器機能障害を含むいくつかの疾患のための再生可能な治療法として研究されてきた。ジストロフィー骨格筋、梗塞、心臓、および機能不全、尿管への筋芽細胞移植は、移植された筋芽細胞は、宿主組織内の筋線維に分化し、これらの疾患における部分的な機能改善を表示することができますことを示している。したがって、骨格musclから静止衛星細胞の効率的な精製方法の開発Eだけでなく、衛星細胞由来の筋芽細胞培養および筋芽細胞のための移植法の確立など、衛星細胞の自己再生、活性化、及び分化の背後にある分子メカニズムを理解するために不可欠です。また、筋ジストロフィー、その他の再生の病気のための細胞ベースの治療法の開発は、これらの要因に依存している。
しかし、静止衛星細胞の現在の将来の精製方法は、高価な蛍光活性化細胞選別（FACS）装置の使用を必要とする。ここでは、ソーティング（MACS）、磁気活性化細胞が続く酵素的解離による成体マウスの骨格筋からの静止衛星細胞の、急速な経済的、かつ信頼性の高い精製のための新しい手法を提案する。純粋な静止衛星細胞の単離後、これらの細胞は、何代かの継代後の筋芽細胞を大量に得るために培養することができる。これらの新たに単離した静止衛星細胞またはex vivoで増殖させた筋芽細胞は、心臓毒に移植することができる（CTX）筋線維の再生にドナー由来細胞の寄与を調べるために、マウスの骨格筋の再生に誘導されるだけでなく、自己複製の検査のための衛星細胞区画へ活動。
Introduction
筋衛星細胞は、骨格筋線維の基底膜の下に位置する筋原幹細胞の小集団である。それらはのPax7、のPax3、c-Metの、M-カドヘリン、CD34、シンデカン3の発現を特徴とし、カルシトニン、1 – 3。衛星細胞、筋肉幹細胞などの筋再生に関与することが証明されている。大人の筋肉では、衛星細胞は4-8通常、有糸分裂的に静止状態にある。損傷後、衛星細胞は活性化され、MyoDの発現を開始し、そしてその子孫を展開し、細胞周期を入力して、筋原性前駆細胞又は筋芽3と呼ばれる。細胞分裂のいくつかのラウンド後、筋芽細胞は、成熟筋繊維に続いて多核筋管へと分化するために、相互に細胞周期およびヒューズを終了する。大人の筋肉から分離された筋芽細胞は、容易にex vivoで拡張することができます。筋肉を再生させるにしてに筋線維になる筋芽細胞の能力非筋組織における異所性フォーム筋線維は、筋芽細胞移植、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）4のための潜在的な治療アプローチ、泌尿器機能障害9、および心不全10によって利用される。確かに、筋芽細胞は正常にMDX（DMDモデル）マウスおよびDMD患者11から14の両方の筋肉に移植されてきた。注入された筋芽細胞は、正常な、罹患筋の組織学および機能を改善するために、宿主筋線維と融合する。以前の研究は、筋芽細胞の亜集団は、より細胞様幹と筋再生5中に筋肉になった未分化状態のままにしていることを明らかにした。最近の研究は、成体筋から新たに単離されたサテライト細胞、筋肉5-8の再生に、より効率的な生着及び自己再生活性を示す幹細胞様集団を含有することが示されている。従って、成体骨格MUから静止衛星細胞の純粋な集団の精製SCLEは、衛星細胞、筋芽細胞と筋再生の生物学を理解するため、および細胞ベースの治療法の開発のために不可欠である。
しかし、静止衛星細胞の現在の将来の精製方法は、高価な蛍光活性化細胞選別（FACS）1,2,6-8機械の使用を必要とする。また、FACSレーザ露光は、静止衛星細胞15の下部収率を引き起こす分離時に細胞死を誘導する傾向がある。ここでは、成体マウスの骨格筋からの静止衛星細胞の、急速な経済的、かつ信頼性の高い精製のための新しい手法を提案する。この方法では、ソーティング（MACS）、磁気活性化細胞が続く酵素的解離を利用しています。純粋な静止衛星細胞の単離後、これらの細胞は、何代かの継代後の筋芽細胞を大量に得るために培養することができる。我々はまた示すことが、これらの新たに単離された静止衛星細胞またはex VIの筋肉内注射VO展開さ筋芽細胞が心臓毒に移植することができる（CTX）筋線維だけでなく、自己再生活動の検査のための衛星細胞区画への再生へのドナー由来細胞の寄与を調べるために、マウスの骨格筋の再生に誘導される。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは、静止衛星細胞を容易にコラゲナーゼ消化および表面抗体媒介MACS分離による成体マウスの骨格筋から精製することができる。この方法では、約6時間かかり、このようなFACS装置など高価な設備を必要としません。さらに、この方法は、表面抗体媒介FACS分離に比べて比較的安価である。 FACSレーザ露光分離15の間に細胞死を誘導する傾向があるため、静止衛星細胞の…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、Myf5の+ / nLacZマウスを提供するための博士Shahragim Tajbakhshに感謝します。我々はまた、この原稿の重要な読書のためのアレクサンダー·フロン川とマイケルBaumruckerに感謝します。この作品は、筋ジストロフィー協会（MDA）とグレゴリーMarzolfジュニア、MDセンター賞からの補助金によって支えられている。
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
Referências
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