Isolamento, cultura e transplante de células musculares satélite
Summary
O isolamento e cultura de uma população pura de células satélites quiescentes, uma população de células estaminais musculares, é essencial para a compreensão da haste músculo biologia celular e regeneração, bem como o transplante de células estaminais para terapias em distrofia muscular e outras doenças degenerativas.
Abstract
Células satélites musculares são uma população de células-tronco necessárias para o desenvolvimento muscular esquelética pós-natal e da regeneração, sendo responsável por 2-5% dos núcleos sublaminal nas fibras musculares. No músculo adulto, as células satélites são normalmente mitose repouso. Após lesão, no entanto, as células satélites iniciar a proliferação celular para produzir os mioblastos, as suas progênies, para mediar a regeneração dos músculos. O transplante de mioblastos derivados de células-satélite tem sido amplamente estudada como uma possível terapia para várias doenças regenerativas incluindo distrofia muscular, insuficiência cardíaca e disfunção urológica. O transplante de mioblastos em Latossolo músculo esquelético, coração infartado, e disfuncionamento ductos urinários mostrou que mioblastos enxertados podem se diferenciar em fibras musculares nos tecidos do hospedeiro e apresentar melhora funcional parcial nestas doenças. Portanto, o desenvolvimento de métodos de purificação eficiente de células satélites quiescentes de muscl esqueléticoe, assim como o estabelecimento de culturas de células derivadas de mioblastos de satélite e métodos de transplante de mioblastos, são essenciais para a compreensão dos mecanismos moleculares por trás de células auto-renovação satélite, ativação e diferenciação. Além disso, o desenvolvimento de terapias à base de células para a distrofia muscular e outras doenças regenerativos são também dependentes desses factores.
No entanto, os métodos de purificação de correntes de potenciais células satélites quiescentes requerem o uso de caras activada por fluorescência (FACS) de células máquinas. Aqui, apresentamos um novo método para a purificação rápida, econômica e confiável de células satélites quiescentes de rato adulto músculo esquelético por dissociação enzimática seguido de célula magnética ativado triagem (MACS). A seguir ao isolamento de células satélites quiescentes puros, estas células podem ser cultivadas para obter um grande número de mioblastos após várias passagens. Estes recém-isoladascélulas satélites quiescentes ou ex vivo mioblastos expandidas podem ser transplantadas em cardiotoxina (CTX) induzida por rato em regeneração do músculo esquelético para examinar a contribuição de células derivadas do dador para a regeneração das fibras musculares, bem como para compartimentos celulares por satélite para o exame da auto-renovação actividades.
Introduction
Células satélites musculares são uma pequena população de células-tronco miogênicas localizadas abaixo da lâmina basal das fibras musculares esqueléticas. Eles são caracterizados pela expressão de Pax7, Pax3, c-Met, M-caderina, CD34, Syndecan-3, e calcitonina de 1-3. Células satélites têm provado ser responsável para a regeneração muscular, as células-tronco musculares. No músculo adulto, as células satélites são normalmente mitose repouso 4-8. Após lesão, as células satélites são ativadas, iniciar expressão de MyoD e entrar no ciclo celular para expandir a sua descendência, chamadas de células precursoras miogênicas ou mioblastos 3. Depois de vários ciclos de divisão celular, mioblastos sair do ciclo celular e fusível para o outro, a fim de sofrerem diferenciação em miotubos multi-nucleadas, seguido por fibras musculares maduras. Mioblastos isolados de músculo adulto pode facilmente ser expandidas ex vivo. A capacidade para mioblastos para tornar as fibras musculares na regeneração muscular eformar fibras musculares ectópica em tecidos nonmuscle é explorada por transplante de mioblastos, uma aproximação terapêutica potencial para a distrofia muscular de Duchenne (DMD), 4, disfunção urológica 9, e a insuficiência cardíaca 10. Com efeito, os mioblastos foram transplantadas com sucesso no músculo de ambos mdx (modelo DMD) e ratos doentes DMD 11-14. Os mioblastos normais injectados fundir com as fibras musculares de acolhimento para melhorar a histologia e função do músculo doente. Trabalhos anteriores demonstraram que subpopulações de mioblastos são mais células-tronco semelhantes e permanecem em um estado indiferenciado mais no músculo durante a regeneração muscular 5. Trabalhos recentes mostraram que as células satélites recém-isoladas de músculo adulto conter uma população de células-tronco como que exibe o enxerto mais eficiente e atividade auto-renovação na regeneração muscular 5-8. Portanto, a purificação de uma população pura de células satélites quiescentes de mu esquelético adultoesclerose é essencial para compreender a biologia de células satélites, mioblastos e regeneração muscular, e para o desenvolvimento de terapias baseadas em células.
No entanto, os métodos de purificação de correntes de potenciais células satélites quiescentes requerem a utilização de um activado por fluorescência celular separação caro (FACS) da máquina 1,2,6-8. Além disso, a exposição ao laser FACS tende a induzir a morte celular durante a separação, o que faz com que o rendimento mais baixo de células quiescentes de satélite 15. Aqui, apresentamos um novo método para a purificação rápida, econômica e confiável de células satélites quiescentes de rato adulto músculo esquelético. Este método utiliza dissociação enzimática seguido de célula magnética ativado triagem (MACS). A seguir ao isolamento de células satélites quiescentes puros, estas células podem ser cultivadas para obter um grande número de mioblastos após várias passagens. Mostramos também que a injeção intramuscular dessas células satélites quiescentes recém-isoladas ou ex vimioblastos vo expandidos podem ser transplantadas para cardiotoxina (CTX) induzida regeneração do músculo esquelético do rato para examinar a contribuição de células derivadas de doadores para regenerar as fibras musculares, bem como para os compartimentos de células satélites para o exame de atividades de auto-renovação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste protocolo, as células satélites quiescentes podem ser facilmente purificadas a partir de músculo esquelético de ratinhos adultos por digestão com colagenase e de separação MACS mediada por anticorpos da superfície. Este método leva cerca de 6 horas e não precisa de nenhum equipamento caro, como uma máquina de FACS. Além disso, este método é relativamente barato em comparação com a superfície mediada por anticorpo de separação FACS. Uma maior produção de células quiescentes de satélite també…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Dr. Shahragim Tajbakhsh para a prestação de camundongos Myf5 + / nLacZ. Agradecemos também a Alexander Hron e Michael Baumrucker para a leitura crítica do manuscrito. Este trabalho foi financiado por doações da Associação de Distrofia Muscular (MDA) e Gregory Marzolf Jr. MD Centro Award.
Materials
| Materials | |||
| Collagenase Type 2 | Worthington | CLS-2 | 100 mg |
| Marigel | BD Biosciences | 356234 | 5 ml |
| DMEM | Gibco-Invitrogen | 10569010 | 500 ml |
| Collagen (Rat Tail) | BD Biosciences | 354236 | 100 mg (3-4 mg/ml) |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099-500ML | 500 ml |
| bFGF, human, Recombinant | Gibco-Invitrogen | PHG0263 | 1 mg |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A5611-1G | 1 g |
| Ham’s F10 Medium | Gibco-Invitrogen | 11550-043 | 500 ml |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | 3600511 | 500 ml |
| Horse Serum | Gibco-Invitrogen | 26050088 | 500 ml |
| Penicillin/Streptmycin | Gibco-Invitrogen | 15640055 | 100 ml |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco-Invitrogen | 14190144 | 500 ml |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco-Invitrogen | 25200072 | 500 ml |
| 18G needle with 12cc Syringe | Fisher Scientific | 22-256-563 | |
| Cell strainer (70 μm) | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| Falcon 50 ml tube | BD Biosciences | 352098 | |
| Falcon 15 ml tube | BD Biosciences | 352097 | |
| 10 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353003 | |
| 6 cm tissue culture plate | BD Biosciences | 353004 | |
| Falcon 10 ml disposable pipet | BD Biosciences | 357551 | |
| Anti-CD31 antibody-PE | eBiosciences | 12-0311 | |
| Anti-CD45 antibody-PE | eBiosciences | 30-F11 | |
| Anti-Sca1 antibody-PE | eBiosciences | Dec-81 | |
| Anti-Integrin α7 antibody | MBL International | ABIN487462 | |
| Anti-PE MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| Anti-Mouse IgG MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-402 | |
| Mini & MidiMACS Starting Kit | Miltenyi Biotec | 130-091-632 | |
| MS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| LD Column | Miltenyi Biotec | 130-042-901 | |
| Cardiotoxin | Sigma Aldrich | C9759-1MG | Stock 10 μM in PBS |
| 31G Insulin syringe | BD Biosciences | 328438 | |
| Refrigerated Microcentrifuge (Microfuge 22R) | Beckman Coulter | 368826 | |
| S241.5 Swinging Bucket Rotor | Beckman Coulter | 368882 | |
| Refrigerated Centrifuge (Allegra X-22R) | Beckman Coulter | 392187 | |
| Nod/Scid immunodeficient mice | Charles River Laboratories | Strain Code 394 | Use 2 months old mice |
| Reagents | |||
| Name of the reagent | Recipie | ||
| 10% and 2% FBS DMEM | DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) with 10% or 2% FBS (Fisher Scientific #03600511) and 1% Penicillin/Streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 0.2% Collagenase solution | Collagenase Type 2 (Worthington, #CLS-2), Stock: 50 ml: 100 mg Collagenase Type 2 in 10% FBS DMEM. | ||
| 10% Matrigel solution | Matrigel (BD Biosciences: #356234) is placed on ice for thawing overnight. Five ml Matrigel is dilute by 45 ml DMEM and 5 ml aliquots are stored at -20°C until use. | ||
| Matrigel-coated plate | Five ml of 10% Matrigel solution is placed on ice for thawing and is used for coating 10 cm plate at room temprature for 1 minutes. The plate is placed in 5% CO2 incubator at 37°C for 30 minute after removing Matrigel solution, and let the plate dry in culture hood for another 30 minutes. Removed 10% Matrigel solution is stored at -20°C for reusing. | ||
| 0.01% Collagen solution | Mix to final: 0.01% Collagen (Collagen, Rat Tail: BD Biosciences #354236) in 0.2% acetic acid (320099-500ML) in ddH2O. | ||
| Collagen-coated plate | Add 5 ml or 2 ml of Collagen solution to a 10 cm or 6 cm tissue culture plate and let sit at room temperature for three hours. Then, aspirate off liquid and allow to dry in culture hood for 30 min to overnight. Plates can be stored at room temperature for several months. | ||
| bFGF stock solution | bFGF, Human, Recombinant (Gibco-Invitrogen #PHG0263, 1 mg) is dissolved with 0.1% BSA solution consisting of 1 mg BSA (Sigma-Aldrich #A5611-1G) and 2 ml ddH2O (0.5 mg/ml bFGF). Aliquot 20 μl in 500 μl microcentrifuge tubes and kept in -80°C. | ||
| Myoblast medium | 500 mL HAM’S F10 Medium (Gibco-Invitrogen #11550-043) supplemented with 20% FBS (Fisher Scientific #03600511), Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055), and 10 μg of bFGF (20 μl of bFGF stock). | ||
| Differentiation medium | 500 mL DMEM (Gibco-Invitrogen #10569010) supplemented with 5% Horse serum (Gibco-Invitrogen #26050088) and 1% Penicillin/streptomycin (Gibco-Invitrogen #15640055). | ||
| 10 μM Cardiotoxin stock | 1 mg Cardiotoxin (EMD Millipore #217504-1MG) is dissolved with 13.9 ml PBS. |
Referências
- Fukada, S., et al. Purification and cell-surface marker characterization of quiescent satellite cells from murine skeletal muscle by a novel monoclonal antibody. Exp. Cell Res. 296, 245-255 (2004).
- Hirai, H., Verma, M., Watanabe, S. C. T., Asakura, Y., Asakura, A. MyoD regulates apoptosis of myoblasts through microRNA-mediated down-regulation of Pax3. J. Cell Biol. (191), 347-365 (2010).
- Asakura, A. Stem cells in adult skeletal muscle. Trends Cardiovasc. Med. 13, 123-128 (2003).
- Partridge, T. A. Cells that participate in regeneration of skeletal muscle. Gene Ther. 9, 752-753 (2002).
- Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122, 289-301 (2005).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456, 502-506 (2008).
- Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells. Methods Mol. Biol. 621, 165-173 (2010).
- Yokoyama, T., Huard, J., Chancellor, M. B. Myoblast therapy for stress urinary incontinence and bladder dysfunction. World J. Urol. 18, 56-61 (2000).
- Menasche, P. Skeletal muscle satellite cell transplantation. Cardiovasc. Res. 58, 351-357 (2000).
- Huard, J., et al. Myoblast transplantation produced dystrophin-positive muscle fibres in a 16-year-old patient with Duchenne muscular dystrophy. Clin. Sci. 81, 287-288 (1991).
- Tremblay, J. P., et al. Results of a triple blind clinical study of myoblast transplantations without immunosuppressive treatment in young boys with Duchenne muscular dystrophy. Cell Transplant. 2, 99-112 (1993).
- Gussoni, E., Blau, H. M., Kunkel, L. M. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3, 970-977 (1997).
- Palmieri, B., Tremblay, J. P., Daniele, L. Past, present and future of myoblast transplantation in the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Pediatr. Transplant. 14, 813-819 (2010).
- Mollet, M., Godoy-Silva, R., Berdugo, C., Chalmers, J. J. Acute hydrodynamic forces and apoptosis: a complex question. Biotechnol. Bioeng. 98, 772-788 (2007).
- Asakura, A., Rudnicki, M. A. Side population cells from diverse adult tissues are capable of in vitro hematopoietic differentiation. Exp. Hematol. 30, 1339-1345 (2002).
- Asakura, A., et al. Increased survival of muscle stem cells lacking the MyoD gene after transplantation into regenerating skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 16552-16557 (2007).
- Gerard, X., et al. Real-time monitoring of cell transplantation in mouse dystrophic muscles by a secreted alkaline phosphatase reporter gene. Gene Ther. 16, 815-819 .
- Tajbakhsh, S., Rocancourt, D., Cossu, G., Buckingham, M. Redefining the genetic hierarchies controlling skeletal myogenesis Pax-3 and Myf-5 act upstream of MyoD. Cell. 89, 127-138 (1997).
- Beauchamp, J. R., et al. Expression of CD34 and Myf5 defines the majority of quiescent adult skeletal muscle satellite cells. J. Cell Biol. 151, 1221-1134 (2000).
- Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Seale, P., Asakura, A., Rudnicki, M. A. Reduced differentiation potential of primary MyoD-/- myogenic cells derived from adult skeletal muscle. J. Cell Biol. 144, 631-643 (1999).
- Bischoff, R. Regeneration of single skeletal muscle fibers in vitro. Anat. Rec. 182, 215-235 (1975).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell Biol. 159, 123-134 (2002).
- Kuang, S., Kuroda, K., Le Grand, F., Rudnicki, M. A. Asymmetric self-renewal and commitment of satellite stem cells in muscle. Cell. 129, 999-1010 (2007).
- Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134, 37-47 (2008).
- Farina, N. H., et al. A role for RNA post-transcriptional regulation in satellite cell activation. Skelet. Muscle. 2, 21-21 (2012).
- Tanaka, K. K., Hall, J. K., Troy, A. A., Cornelison, D. D., Majka, S. M., Olwin, B. B. Syndecan-4-expressing muscle progenitor cells in the SP engraft as satellite cells during muscle regeneration. Cell Stem Cell. 4, 217-225 (2009).
- Pallafacchina, G., et al. An adult tissue-specific stem cell in its niche: a gene profiling analysis of in vivo quiescent and activated muscle satellite cells. Stem Cell Res. 4, 77-91 (2009).
