باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات
Summary
البكتيريا تنتج مركبات يفرز التي لديها القدرة على التأثير في علم وظائف الأعضاء من جيرانهم الميكروبية. نحن هنا وصف شاشة coculture التي تسمح الكشف عن مثل هذه التفاعلات بين الأنواع بوساطة كيميائيا عن طريق خلط التربة مع سلالات الميكروبات مراسل النسخي الفلورسنت من العصوية الرقيقة على وسائل الاعلام الصلبة.
Abstract
في الطبيعة، ونادرا ما توجد البكتيريا في عزلة، بل هي بدلا محاطة مجموعة متنوعة من الكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي تغير البيئة المحلية عن طريق إفراز نواتج الأيض. هذه المركبات لديها القدرة لتعديل وظائف الأعضاء والتفريق بين جيرانهم والميكروبية من العوامل الهامة المحتملة في إنشاء وصيانة للمجتمعات الميكروبية المعقدة. قمنا بتطوير شاشة القائم على مضان coculture لتحديد مثل هذه التفاعلات الميكروبية بوساطة كيميائيا. ينطوي على الشاشة الجمع بين النسخي فلوري مراسل سلالة بالميكروبات البيئية على وسائل الاعلام الصلبة والسماح للمستعمرات أن ينمو في coculture. تم تصميم مراسل النسخي الفلورسنت بحيث السلالة البكتيرية اختيار تتفلور عندما يتم التعبير عن النمط الظاهري معينة من الفائدة (أي تشكيل بيوفيلم، تبوغ والإنتاج عامل الفوعة، الخ.) يتم تنفيذ فحص في ظل ظروف النمو عرجإعادة هذا النمط الظاهري لا يتم التعبير (وبالتالي سلالة المراسل هو عادة nonfluorescent). عندما يفرز الميكروب والبيئية المستقلب الذي ينشط هذا النمط الظاهري، فإنه ينشر من خلال أجار وينشط مراسل بناء الفلورسنت. وهذا يسمح للتحريض-المنتجة للميكروب المستقلب ليتم الكشف عن: هم المستعمرات nonfluorescent معظم الأقرب إلى المستعمرات الفلورسنت. وبالتالي، هذه الشاشة يسمح تحديد الميكروبات البيئية التي تنتج نواتج إنتشاري التي تنشط استجابة فسيولوجية معينة في سلالة المراسل. يناقش هذا المنشور كيفية: أ) تحديد شروط الفحص coculture المناسبة، ب) إعداد المراسل والميكروبات البيئية للفحص، ج) أداء الشاشة coculture، د) عزل المفترضة حمل الكائنات الحية، وه) تأكيد نشاطهم في الشاشة الثانوية. قمنا بتطوير هذه الطريقة للكشف عن الكائنات الحية في التربة التي تنشط بيوفيلم مصفوفة الإنتاج في العصوية الرقيقة </م>، ولكن نحن أيضا مناقشة الاعتبارات لتطبيق هذا النهج لغيرها من البكتيريا وراثيا لين العريكة.
Introduction
ونحن مهتمون في فهم كيف تؤثر على الأيض التي تفرز البكتيريا علم وظائف الأعضاء وتطوير الميكروبات المجاورة. وقد اتسمت العديد من نواتج الأيض للآثار الحيوية النشطة على الميكروبات الأخرى. وتشمل مثالين موصوفة وصفا جيدا المضادات الحيوية، والتي تمنع نمو الميكروبات الأخرى، والجزيئات الاستشعار عن النصاب القانوني، الذي يغير من التعبير الجيني العالمي من الميكروبات الأخرى. ومع ذلك، والبكتيريا تنتج العديد من المنتجات الأخرى الطبيعية جزيء صغير التي ليس لها bioactivities المعروف 1. نحن نفترض أن البكتيريا تطورت والحفاظ على القدرة على إنتاج بعض هذه المركبات لأنها تسمح لهم لتعديل الفيزيولوجيا الخلوية من الجيران الميكروبية في المجتمعات الميكروبية المعقدة التي توجد داخل معظم البكتيريا.
أنواع الخلايا العصوية الرقيقة
فقد ركزنا دراستنا على التفاعلات الميكروبية بوساطة كيميائيا التي تنطوي BacilLUS الرقيقة. هذا ليس فقط بسبب مكانتها باعتبارها البكتيريا إيجابية الجرام النموذج والأدوات الوراثية الناتجة المتاحة للتلاعب، ولكن أيضا بسبب قدرتها على التمايز إلى أنواع الخلايا تتميز. وتشمل الأمثلة الخلايا التي هي: السباحة؛ إنتاج المصفوفة خارج الخلية ما هو مطلوب لتشكيل بيوفيلم قوية؛ المختصة لتولي DNA من البيئة، وsporulating، من بين أمور أخرى 2. كل من هذين النوعين من الخلايا يعبر عن regulon النسخي المميزة التي تجعلها من الناحية الفسيولوجية و / أو جسديا متميزة من أشقائهم متطابقة وراثيا. في ظل العديد من الظروف النمو، أنواع الخلايا متعددة تتعايش مختلف المجموعات السكانية الفرعية كما في مستعمرة واحدة من B. الخلايا الرقيقة 3. على الرغم من أن العديد من أنواع البكتيريا قد تظهر مشابهة نوع من الخلايا عدم التجانس، فإن هذه الظاهرة لا سيما وقد درس جيدا في B. الرقيقة.
على وجه الخصوص، هي الجينات التي الاستعراض الدوري الشاملegulated داخل كل من هذه B. محددة وقد تم تحديد أنواع الخلايا الرقيقة. تحديد هذه الجينات upregulated ضروري لعمل الموصوفة هنا لأن الكثير من هذه الظواهر الميكروبية من الفائدة من الصعب أو من المستحيل مراقبة مباشرة. على سبيل المثال، لا يمكننا الكشف عن سمة بصريا مثل السباحة على الصلبة (1.5٪) لوحات أجار، على الرغم من جزء من السكان من B. الخلايا الرقيقة إنتاج سياط في ظل هذه الظروف 3. مثال آخر هو بيوفيلم مصفوفة الإنتاج. يمكن تصور إنتاج مصفوفة من قبل مستعمرة مورفولوجيا (كما أنه يؤدي إلى المستعمرات متجعد ظاهريا)، ولكن فقط على بعض المتوسطة النمو، وفقط بعد عدة أيام من النمو 4. ومع ذلك، من خلال معرفة الجينات التي upregulated خلال التمايز، يمكننا بناء صحفيين النسخي والتي تكون بمثابة علامات لتمايز الخلايا إلى أنواع الخلايا هذه.
بنيات مراسل
هذه ر الفلورسنتتتكون صحفيين ranscriptional من المروجين لجينات معينة الخلية نوع القيادة إنتاج الجين المراسل، على سبيل المثال بروتين فلوري. وتشمل الأمثلة P-YFP حاج (للسباحة الخلايا)، P-تابا YFP (للخلايا المنتجة للمصفوفة بيوفيلم)، وP-sspB YFP (لsporulating الخلايا)، حيث P س يشير إلى منطقة المروج لجين س. تتكامل هذه التركيبات مراسل في مكان محايد على كروموسوم (الشكل 1 و انظر أدناه) بحيث يتم ترك التنظيم الأم من النمط الظاهري سليمة. ومع ذلك، والآن عندما خلية يعبر عن هذا النمط الظاهري، فإنه يعرب أيضا عن بروتين فلوري. هذا يوفر تصور بسهولة قراءة من تفعيل سيما السلوك المظهري، مما يسمح لنا للكشف عن الميكروبات التي تستخدم لتنشيط هذه الاستجابة الفسيولوجية. على الرغم من أن مثل هذه صحفيين تستخدم عادة في علم الأحياء الدقيقة، فإنها لم تطبق على نطاق واسع في الشاشات لidentifوقد وصفت التفاعلات الأيضية ذ بين الميكروبات قبل هذه الطريقة 5.
هناك عدد من الاعتبارات المهمة في تصميم وبناء من نوع خاص خلية سلالات المراسل. لقد استخدمت صحفيين الفلورسنت النسخي حصرا، على الرغم من أن أنواع أخرى من بنيات ممكنة بالتأكيد. نحن لا نشجع استخدام اندماج متعدية كعلامات لنوع من الخلايا في التمايز الشاشة لدينا، ولكن لسببين: 1) الرغبة في مغادرة نوع معين من البروتين الخلية الأم رابط الجأش، و 2) الاعتراف بأن منتشر، خلية وسوف يكون من الأسهل مضان واسعة للكشف عن نقاط والمترجمة داخل الخلايا (مشتركة مع اندماج متعدية).
مراسل اختيار الجينات
بعد البت في استخدام النسخ باعتبارها من القراءة، يجب تحديد الجين مراسل (على سبيل المثال LacZ، مضان، أو luciferase المراسل). LacZ له ميزة خاصة التي تحتاج إلى أقلأوتوماتيكية معدات للكشف، ولكن هناك احتمال أكبر بكثير من ايجابيات كاذبة بين الميكروبات البيئية. في أيدينا، كان مستوى خلفية لاك + الكائنات بين الميكروبات في التربة باهظة عالية (>> كان 10٪ من الميكروبات في التربة الأزرق (لاك +) على لوحات X-غال؛ لا تظهر البيانات). فمن الممكن أنه من خلال المعايرة تركيز X-غال في المتوسط، يمكن أن يكون الأمثل لهذا تسمح باستخدام مراسل X-غال، على الرغم من أننا لم يحاول ذلك. يوفر luciferase المراسل حساسية عالية للكشف عن ومراسل معظم متعامد: هناك تقريبا أي فرصة من الميكروبات البيئية كونها الانارة بطبيعتها. ومع ذلك، وجدنا أنه من الصعب تحديد الأجهزة في مؤسستنا التي سمحت الكشف التلألؤ عبر لوحات بيتري بأكملها، كما تم تصميم معظم لمسح المناطق المترجمة فقط في لوحات متعددة جيدا. قد يكون هناك أيضا مضاعفات في تصور المستعمرات الانارة بطريقة تسمح أيضا الجسدية في وقت واحد هوolation الكائنات حمل. أثناء استخدام مؤتمنة قد جعلت هذا الأمر ممكنا، ونحن بدلا من ذلك انتخاب لاستخدام النسخي صحفيين الفلورسنت، والتي ثبت للعمل في B. الرقيقة، شريطة حساسية كافية للكشف وانخفاض معدلات إيجابية كاذبة بين الكائنات الحية في التربة، ويسمح لهم باستخدام الأجهزة المتوفرة بسهولة من كلا التصور وإجراءات العزل.
اختيار Fluorophore
سوف fluorophore محددة مختارة تعتمد على الأنواع البكتيرية الخاصة بك، والمتوسطة النمو أجار الذي تستخدمه، ومرشح مضان خاص يحدد المتاحة لديك. مع الأجهزة لدينا، وجدنا أن كلا من ب. الرقيقة مستعمرات أنفسهم وأجار كانوا نمت على معارضها أقل مضان الخلفية عندما استخدمت YFP (بروتين فلوري الصفراء) مرشحات، مما يجعل أن مراسل متفوقة على GFP (بروتين الفلورية الخضراء) في أيدينا. استخدام كودون من البروتينات الفلورية هيالأمثل في كثير من الأحيان لحقيقيات النوى، مما يجعل من المهم لاختيار fluorophore المعروفة إما من الأدب للعمل في الأنواع البكتيرية الخاصة بك، أو لاختباره بشكل صريح باستخدام المروج التأسيسية. وهناك عدد كبير من المتغيرات المتطورة باستمرار بروتين فلوري المتاحة حاليا 6، والتي تم استعراضها في عدد من المصادر 7،8، والبعض منها توفير التوجيه صراحة على اختيار بروتين فلوري المناسبة لتجربتك 9.
اختيار المروج
فإن اختيار المروج تعتمد إلى حد كبير على نوع من الخلايا أو النمط الظاهري في المصالح. للكائنات مثل B. الرقيقة، وقد وضعت بعض الخلايا من نوع الجينات مراسل محددة في الأدب. لسلالات بكتيرية أخرى، ودراسة البيانات ميكروأري أو النسخي وسوف يكون من الضروري توفير المعلومات حول الجينات التي upregulated للغاية في ظل الظروف حيث نوع من الخلايا اهتمامك طو تجلى. المفهرسة دراسة حديثة نسخ من B. الرقيقة تحت 104 ظروف النمو المختلفة باستخدام ميكروأرس تبليط 10. تقدم هذه الورقة معلومات شاملة عن الجينات التي upregulated للغاية في ظل ظروف مختلفة، والتي لا تقدر بثمن لأقل الظواهر تتميز جيدا.
بدلا من رسم خرائط دقيقة لمناطق المروج كل الجينات في المصالح، ونحن عادة ببساطة استخدام تسلسل غليان 200-500 المنبع من الجين كما المروج. طول التسلسل الدقيق يعتمد على السياق الجيني: وتستخدم المناطق أقصر عند الضرورة لتجنب بما في ذلك المناطق الترميز المنبع من إطارات القراءة المفتوحة المجاورة.
مواضع محايدة والتكامل
كيفية الحفاظ على بناء مراسل في السلالة البكتيرية الخاصة بك يصبح السؤال النهائي في تصميم الفلورسنت سلالة مراسل النسخي. في البكتيريا، وكثيرا ما تحتفظ الجينات ذات الاهتمامعلى البلازميدات باستخدام اختيار المضادات الحيوية. ومع ذلك، فإنه قد لا يكون من الممكن استخدام المضادات الحيوية خلال coculture دون قتل الميكروبات البيئية. إذا تمسك البلازميدات ثابت في الأنواع البكتيرية الخاصة بك، قد يكون من الممكن تنمو البكتيريا الخاصة بك تحتوي على مراسل المنقولة البلازميد في وجود المضادات الحيوية لإعداد المراسل الخاص لفحص، ومن ثم القضاء على المضادات الحيوية خلال coculture نفسها على أمل أن البلازميد سوف يتم الاحتفاظ بما فيه الكفاية للسماح لمضان. ومع ذلك، إذا فقدت البلازميدات بسهولة في البكتيريا، أو تضيع في ظل ظروف الإجهاد، وهذا لن يكون خيارا قابلا للتطبيق. في كثير من الحالات، فإن أفضل حل هو دمج بناء على مراسل الكروموسوم البكتيري، والذي يسمح صيانة مستقرة لمراسل حتى في غياب التحديد. من أجل التكامل لعدم تعطيل التعبير العادي أو تنظيم الجينات اهتمامك، ونحن نوصي الاندماج في موقع خارج الرحم على الكروموسوم الذي كاليفورنيان بمثابة "مكان محايد". في B. الرقيقة هذه المواقع التكامل هي الجينات التي – عندما تحور – ينقل النمط الظاهري في بعض وسائل الاعلام الحد الأدنى (السماح الكشف عن هويته integrants دون اختيار المضادات الحيوية)، ولكن لا يغير النمو أو معدلات تبوغ في الوسائط الغنية، وتشمل مثل هذه الجينات كما amyE، هلال، thrC، pyrD، gltA، وساكا (نقل القدرة على الاستفادة من النشا، β-galactosides، ثريونين، اليوراسيل، الغلوتامات، والسكروز، على التوالي) 11-13.
بينما التكامل في هذه الجينات قد استخدمت بشكل موثوق لسنوات عديدة في B. الرقيقة (وخاصة في amyE وهموم)، قد لا تكون متاحة للجينات في العديد من الأنواع البكتيرية الأخرى المعرفة مماثلة. استخدام مواقع الحجز فج هي البدائل كبيرة لمواقع التكامل الكروموسومات محايدة: لدينا العديد من أنواع محددة 14-16، وكذلك المواقع تكامل العامة مثل موقع المرفق Tn7 (تى تى Tn7)تم تحديدها واستخدامها لالإدراج الجينات في العديد من الأنواع البكتيرية 17،18.
الميكروبات البيئية
نستخدم التربة كمصدر مباشر من الميكروبات البيئية للشاشة coculture لدينا. يحتوي على التربة والتنوع عالية من الميكروبات، والعديد من هذه الكائنات الحية هي مصدر غني للمنتجات الطبيعية. باستخدام المعلقات السائلة وضعها مباشرة على لوحات لدينا الفلورسنت سلالة مراسل النسخي (دون العزلة مسبقة من البكتيريا من التربة)، ونحن تبسيط كبير في المنهج التجريبي. يمكن إما أن تستخدم التربة مباشرة بعد الحصاد، أو يتم تجميدها في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. استخدام الفوري لديه ميزة أن تنوع أكبر من الميكروبات يمكن أن يحتمل زراعتها، بما في ذلك تلك التي لن تنجو تجميد جيدا. فمن لديه عيب أن تركيز الكائنات الحية في التربة الصالحة للزراعة من هذه العينات غير معروف، وزيادة عدد من لوحات الشاشة التي يجب استخدامها. ديلاستخدام عايد لديه ميزة أن وت م / مل لكل مصدر التربة يمكن تحديد مقدما، والسماح لعدد من المستعمرات الأمثل التي يمكن زراعتها على كل لوحة الشاشة. ومع ذلك، فإنه يتطلب أن تكون الكائنات الحية في التربة قادرة على البقاء التجمد.
نلاحظ أن تنويع تجمع محفز يجري بحثها (أي مصادر التربة) ويبدو أن يكون أكثر فعالية في تحديد التفاعلات بين الأنواع الجديدة من الفحص المتعمق على نفس التربة: لوحظ تنوع أكبر في النشوء والتطور الضربات المحددة في مصفوفة لدينا شاشة الحث على النحو تم فحص مصادر إضافية التربة بدلا من فحص مصادر التربة نفسها أكثر شمولا (EA شانك وR. Kolter، كلية الطب بجامعة هارفارد، نتائج غير منشورة).
نظرة عامة
النهج وصفنا هنا واضح وصريح من حيث المتطلبات التقنية. أنه ينطوي على: 1) بناء مراسل النسخي الفلورسنت في B. الرقيقة أوالأنواع البكتيرية الأخرى ذات الاهتمام، 2) تحديد الشروط التي لم يتم تنشيط هذا المراسل، 3) إعداد aliquots من هذه السلالة مراسل والكائنات ليتم عرضه (في التربة حالتنا، ولكن مصادر أخرى يمكن استخدامها بدلا من ذلك)، 4) خلط هذه مجموعتين من الميكروبات على وسائل الاعلام الصلبة، 5) تحديد وعزل المفترضة حمل الكائنات الحية، و6) مؤكدا أن هذه الكائنات لا بل تنشيط هذا النمط الظاهري في الشاشة الثانوية. مرة واحدة تم تحديدها، وهذه الكائنات الحية ونواتج تفاعلاتها تزويدنا بالأدوات الكيميائية لتعديل السلوك البكتيرية، لدراسة فسيولوجيا بكتيريا والتفاعلات الميكروبية، ويحتمل أن تكون للعمل السقالات الرواية بالنسبة للمركبات العلاجية في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
واحدة من القيود المتأصلة في هذا البروتوكول هو أنه يعتمد على cultivability الكائنات الميكروبية. كما تم توثيقه جيدا 24، معظم الحياة الميكروبية على هذا الكوكب لا يمكن (حتى الآن) يمكن زراعتها تحت ظروف زراعة استكشافها حتى الآن. وبالتالي، فإن عددا كبيرا من التفاعلات بين الأ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف بفضل روبرتو Kolter (كلية هارفارد الطبية) لتقديم المشورة والمساعدة له أثناء وضع هذه الشاشة coculture لا تقدر بثمن. وقالت انها أيضا وذلك بفضل ماثيو القوى لقراءة المخطوطة من أجل الوضوح، وشيا يي تشنغ للمساعدة في الحصول على الشكل 6.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spectrophotometer | Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values. | ||
| Luria broth, Lennox | VWR | 80017-484 | Alternative media sources may be necessary. |
| Glass beads, 3 mm | VWR | 26396-508 | |
| Gel loading tips, round | VWR | 29442-666 | |
| Glass rods | VWR | 59060-069 | |
| Fluorescence dissecting stereoscope | Zeiss | N/A | The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary. |
Referências
- Berdy, J. Bioactive microbial metabolites. J. Antibiot. 58, 1-26 (2005).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol. Rev. 33, 152-163 (2009).
- Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community. Genes Dev. 22, 945-953 (2008).
- Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. Fruiting body formation by Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).
- Shank, E. A., et al. Interspecies interactions that result in Bacillus subtilis forming biofilms are mediated mainly by members of its own genus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 1236-1243 (2011).
- Piston, D. W., Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J., Claxton, N. S., Davidson, M. W. . Introduction to Fluorescent Proteins. , (2013).
- Chudakov, D. M., Matz, M. V., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Fluorescent proteins and their applications in imaging living cells and tissues. Physiol. Rev. 90, 1103-1163 (2010).
- Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. J. Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat. Methods. 2, 905-909 (2005).
- Nicolas, P., et al. Condition-dependent transcriptome reveals high-level regulatory architecture in Bacillus subtilis. Science. 335, 1103-1106 (2012).
- Middleton, R., Hofmeister, A. New shuttle vectors for ectopic insertion of genes into Bacillus subtilis. Plasmid. 51, 238-245 (2004).
- Shimotsu, H., Henner, D. J. Construction of a single-copy integration vector and its use in analysis of regulation of the trp operon of Bacillus subtilis. Gene. 43, 85-94 (1986).
- Guerout-Fleury, A. M., Frandsen, N., Stragier, P. Plasmids for ectopic integration in Bacillus subtilis. Gene. 180, 57-61 (1996).
- Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L., Papp, P. P. Site-specific integrative elements of rhizobiophage 16-3 can integrate into proline tRNA (CGG) genes in different bacterial genera. J. Bacteriol. 184, 177-182 (2002).
- Charpentier, E., et al. Novel cassette-based shuttle vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 70, 6076-6085 (2004).
- Yang, H. Y., Kim, Y. W., Chang, H. I. Construction of an integration-proficient vector based on the site-specific recombination mechanism of enterococcal temperate phage phiFC1. J. Bacteriol. 184, 1859-1864 (2002).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nat. Protoc. 1, 153-161 (2006).
- Craig, N. L. Tn7: a target site-specific transposon. Mol. Microbiol. 5, 2569-2573 (1991).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J. Vis. Exp. (60), e3796 (2012).
- Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).
- Vartoukian, S. R., Palmer, R. M., Wade, W. G. Strategies for culture of ‘unculturable’ bacteria. FEMS Microbiol. Lett. 309, 1-7 (2010).
- Romano, J. D., Kolter, R. Pseudomonas-Saccharomyces interactions: influence of fungal metabolism on bacterial physiology and survival. J. Bacteriol. 187, 940-948 (2005).
- Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix. Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).
- Zengler, K., et al. Cultivating the uncultured. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 15681-15686 (2002).
