שימוש Coculture לזהות אינטראקציות interspecies המתווכת כימית

Summary

חיידקים מייצרים תרכובות מופרשות שיש לו את הפוטנציאל להשפיע על הפיסיולוגיה של חיידקי השכנים שלהם. כאן אנו מתארים מסך coculture המאפשר זיהוי של אינטראקציות כאלה interspecies תיווך כימי על ידי ערבוב של חיידקים אדמה עם זני כתב תעתיק ניאון של Bacillus subtilis על תקשורת מוצקה.

Abstract

בטבע, חיידקים קיימים רק לעתים נדירות בבידוד, הם מוקפים במקום על ידי מערך רחב של מיקרואורגניזמים אחרים המשנים את הסביבה המקומית על ידי הפרשת המטבוליטים. יש מטבוליטים אלה הפוטנציאל לווסת את הפיסיולוגיה ובידול של שכניהם של חיידקים והם גורמים חשובים צפויים בהקמה והתחזוקה של קהילות חיידקים מורכבות. פיתחנו מסך coculture הקרינה מבוססת לזהות אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי מסוג זה. המסך כולל שילוב מתח כתב תעתיק ניאון עם חיידקים סביבתיים על תקשורת מוצקה ומאפשר למושבות לגדול בcoculture. כתב תעתיק הניאון מתוכנן כך שזן החיידקים שנבחר מאיר כאשר הוא מבטא את הפנוטיפ מסוים של עניין (כלומר היווצרות biofilm, נביגה, ייצור גורם ארסיות, וכו '.) הקרנה מתבצעת בתנאי צמיחת wheמחדש פנוטיפ זה לא בא לידי ביטוי (ולכן מתח הכתב הוא בדרך כלל nonfluorescent). כאשר חיידק סביבתי מפריש המטבוליט שמפעיל פנוטיפ הזה, זה מפזר באמצעות אגר ומפעיל את מבנה כתב הניאון. זה מאפשר-ייצור המטבוליט גרימת החיידק כדי להתגלות: הם מושבות nonfluorescent הפרוקסימלי ביותר למושבות ניאון. כך, מסך זה מאפשר זיהוי של חיידקים סביבתיים שמייצרים מטבוליטים diffusible המפעילים תגובה פיזיולוגית מסוימת במתח כתב. פרסום זה דן באופן: א) לבחור תנאי הקרנת coculture מתאימים, ב) להכין את הכתב וחיידקים סביבתיים להקרנה, ג) לבצע את מסך coculture, ד) לבודד משוער גרימת אורגניזמים, וה) לאשר את פעילותם במסך משנית. פיתחנו שיטה זו כדי למסך עבור אורגניזמים אדמה שיפעילו biofilm מטריצת ייצור בsubtilis Bacillus </em>, עם זאת, אנחנו גם לדון בשיקולים ליישום גישה זו לחיידקים גנטי צייתנים אחרים.

Introduction

אנחנו מעוניינים להבין כיצד מטבוליטים שחיידקים מפרישים משפיעים על הפיסיולוגיה והתפתחות של חיידקים שכנים. מטבוליטים רבים כבר מאופיינים לתופעות ביו בחיידקים אחרים. שתי דוגמאות שתוארו היטב כוללות אנטיביוטיקה, אשר לעכב את הצמיחה של חיידקים אחרים, ומולקולות חישת מניין, אשר משנה את ביטוי הגנים העולמי של חיידקים אחרים. עם זאת, חיידקים מייצרים מוצרים רבים אחרים קטנים מולקולה טבעיות שאין להם bioactivities ידוע ^1. אנו משערים כי חיידקים התפתחו ונשמרו את היכולת לייצר כמה מטבוליטים אלה משום שהם מאפשרים להם לווסת את הפיסיולוגיה התאית של חיידקי שכניהם בקהילות חיידקים המורכבים שבתוכה רוב החיידקים להתקיים.

סוגי תאי subtilis Bacillus

אנו מתמקדים המחקרים שלנו על אינטראקציות של חיידקים בתיווך כימי הכרוכים בBacilsubtilis lus. זה לא רק בגלל מעמדו כחיידק מודל גראם חיובי והכלים גנטיים כתוצאה זמינות למניפולציה שלו, אלא גם בגלל יכולתה להתמיין לסוגים מאופיינים תא. דוגמאות כוללות תאים שהם: שחייה; הפקת המטריצה ​​תאית הנדרשת ליצירת biofilm חזקה; מוסמך לקחת את ה-DNA מהסביבה, והמתנבג בין יתר ^2,. כל אחד מסוגי התאים מבטא regulon תעתיק מאפיין שהופך אותם מבחינה פיזיולוגית ו / או פיזי להבדיל מהאחים זהים מבחינה גנטית שלהם. בתנאי גידול רבים, סוגי תאים מרובים לדור בכפיפה אחת אוכלוסיות שונות כמו בתוך מושבה אחת של B. תאי subtilis ^3. למרות שמינים רבים של חיידקים עשויים להפגין את ההטרוגניות מקבילה סוג התא, תופעה זו כבר בעיקר למדה היטב ב ' subtilis.

בפרט, הגנים שהם UPRegulated בתוך כל אחד מB. הספציפי אלה סוגי subtilis תאים זוהו. זיהוי גנים שהוגברו כזה הוא חיוני לעבודה המתוארת כאן כי רבים של פנוטיפים חיידקים אלה של עניין קשה או בלתי אפשריים להתבונן באופן ישיר. לדוגמא, אנחנו לא יכולים מבחינה ויזואלית לזהות תכונה כגון שחייה על צלחות מוצקות (1.5%) אגר, למרות שsubpopulation של B. תאי subtilis לייצר שוטונים בתנאים אלה ^3. דוגמא נוספת היא מטריצת ייצור biofilm. ייצור מטריקס ניתן דמיינו ידי מורפולוגיה מושבה (כפי תוצאות מושבות macroscopically מקומטות), אלא רק במדיום גידול מסוים, ורק אחרי ימים רבים של צמיחת ^4. עם זאת, על ידי לדעת אילו גנים שהוגברו במהלך התמיינות, אנחנו יכולים לבנות לכתבים תעתיק המשמשים כסמנים להתמיינות לסוגי התאים.

כתב בונה

לא ניאון אלהכתבי ranscriptional מורכבים מהיזמים עבור גנים תאים מסוג מסוימים נוהגים בייצור של גן כתב, למשל חלבון פלואורסצנטי. דוגמאות כוללות _{מכשפה-YFP} P (לשחייה בתאים), P _טאפה-YFP (לתאים מייצרי מטריצת biofilm), _ו-P-sspB YFP (להמתנבג תאים), כאשר _x P מציין את האזור המקדם עבור x גן. כתב בונה אלה משולבים לוקוס ניטראלי בכרומוזום (איור 1 וראה להלן), כך שרגולצית יליד פנוטיפ נותרה בשלמותה. עם זאת, כעת, כאשר תא מבטא פנוטיפ זה, זה גם מבטא את חלבון פלואורסצנטי. זה מספק דמיינו בקלות לקריאה מתוך ההפעלה מסוימת פנוטיפי התנהגות, מאפשר לנו להקרין לחיידקים שמפעילים את תגובה פיזיולוגית זה. למרות שכתבים כאלה משמשים בדרך כלל במיקרוביולוגיה, הם לא יושמו באופן רחב במסכים לidentifאינטראקציות מטבוליות y בין חיידקים לפני שיטה זו תוארה ^5.

ישנם מספר השיקולים החשובים בתכנון והבנייה של תאים מסוג ספציפי לזני כתב. יש לנו מנוצלים באופן בלעדי כתבי ניאון תעתיק, אם כי סוגים אחרים של מבנים הם בהחלט אפשריים. אנו לעודד את השימוש בשילובי translational כסמנים לבידול סוג התא במסך שלנו, לעומת זאת, משתי סיבות: 1) הרצון להשאיר מהסוג ספציפי של תאי החלבון האם של שלוות נפש, ו2) ההכרה בכך מפוזר, תא הקרינה רחבה תהיה יותר קלה לזהות מאשר puncta מקומי בתוך תאים (משותף עם התכה translational).

בחירת גן כתב

לאחר שהחליט להשתמש בתעתיק כקריאה החוצה, גן הכתב יש לבחור (לדוגמא LacZ, הקרינה, או בלוציפראז). יש LacZ היתרון של צורך מיוחד לפחותized ציוד לגילוי, אך קיימת סבירות גבוהה הרבה יותר של תוצאות חיוביות שגויות בקרב חיידקים סביבתיים. בידיים שלנו, ברמת הרקע לאק ⁺ אורגניזמים בין החיידקים קרקע הייתה גבוהה להחריד (>> 10% מחיידקי אדמה היו כחולות (Lac ⁺⁾ על צלחות X-gal, מידע לא מוצג). יתכן כי על ידי titrating הריכוז של X-gal במדיום, זה יכול להיות מותאם כדי לאפשר את השימוש בכתב X-gal, למרות שאנחנו לא ניסינו את זה. לוציפראז מספק רגישות גבוהה של איתור והוא הכתב מאונך ביותר: אין כמעט סיכוי לחיידקים סביבתיים להיות זורח מיסודו. עם זאת, מצאנו את זה קשה לזהות מכשור במוסד שלנו, שאיפשר גילוי הארה פני צלחות פטרי כולו, כפי שרובן נועדו לסרוק אזורים רק מקומיים בצלחות רב גם. ייתכן שקיים גם סיבוכים באופן חזותי מושבות זורח באופן שאפשר גם הפיזי בו זמנית הואolation של אורגניזמים וישכנע. בעת השימוש בנאמנים ייתכן שעשה את זה אפשרי, אנחנו במקום שנבחרו לשימוש כתבי תעתיק ניאון, אשר הוכחו לעבוד בB. subtilis, ובלבד רגישות נאותה של זיהוי ושיעורים חיוביים כוזבים נמוכים בקרב אורגניזמים קרקע, ומותר להשתמש במכשור בקלות זמין עבור שניהם להדמיה ונהלי בידוד.

בחירת Fluorophore

Fluorophore הספציפי שנבחר יהיה תלוי במינים החיידקים שלך, המדיום אגר צמיחתו אתה משתמש, ומסנן הקרינה המסוים קובע שיש לך זמין. עם המכשור שלנו, מצאו ששניהם B. subtilis מושבות עצמם ואגרו הם גדלו על הקרינה רקע פחות הוצגה כאשר מסנני YFP (חלבון פלואורסצנטי צהוב) היו בשימוש, מה שהופך את הכתב שעדיף על ה-GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) בידיים שלנו. שימוש קודון של חלבוני ניאוןלעתים קרובות מותאם לאאוקריוטים, שהופך אותו חשוב לבחור fluorophore ידוע או מהספרות לעבודה במינים החיידקים שלך, או לבדוק אותו באופן מפורש באמצעות אמרגן מכונן. מספר גדול של גרסאות חלבון פלואורסצנטי הולכת ומתפתחים זמין ⁶ כיום, שכבר נבדק במספר המקורות ^7,8, שחלקם באופן מפורש לספק הדרכה בבחירת חלבון פלואורסצנטי מתאים לניסוי שלך ^9.

בחירת יזם

הבחירה של אמרגן במידה רבה תהיה תלויה בסוג התא או הפנוטיפ של עניין שלך. לאורגניזמים כגון B. subtilis, כמה גנים כתב תאים מסוג מסוימים הוקמו בספרות. לזני חיידקים אחרים, בחינת microarray או נתונים תעתיק תהיה צורך לספק מידע על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שבו סוג התא שלך שלי ענייןבא לידי ביטוי ים. מחקר שנערך לאחרונה מקוטלג השעתוק של B. subtilis תחת 104 תנאי גידול שונים באמצעות מערכי ריצוף ^10. מאמר זה מספק מידע מקיף על אילו גנים שהוגברו מאוד בתנאים שונים, שלא יסולא בפז לפנוטיפים-היטב מאופיינים פחות.

במקום מיפוי אזורי אמרגן מדויקים לכל גן של עניין, אנחנו בדרך כלל פשוט להשתמש נ"ב הרצף 200-500 במעלה הזרם של הגן כאמרגן. אורך הרצף המדויק תלוי בהקשר הגנומי: אזורים קצרים יותר נמצאים בשימוש בעת צורך כדי להימנע מהכללת אזורי קידוד במעלה הזרם משכן מסגרות קריאה פתוחות.

לוקוסים ואינטגרציה ניטראליים

איך לשמור על הכתב לבנות בזן החיידקים שלך הופכת להיות השאלה האחרונה בעיצוב זן כתב תעתיק ניאון. בחיידקים, גנים של עניין נשמרים בתדירות גבוההעל פלסמידים באמצעות בחירה אנטיביוטיות. עם זאת, ייתכן שלא ניתן יהיה להשתמש באנטיביוטיקה במהלך coculture בלי להרוג את החיידקים הסביבתיים. אם פלסמידים נשמרים ביציבות במינים החיידקים שלך, זה עשוי להיות אפשרי לגדול החיידקים שלך מכילים כתב שמקורן בפלסמיד בנוכחות של אנטיביוטיקה כדי להכין את הכתב שלך להקרנה, ולאחר מכן לחסל אנטיביוטיקה במהלך coculture עצמו בתקווה שיהיה פלסמיד להישמר במידה מספקת כדי לאפשר לקרינה. עם זאת, אם פלסמידים הולכים לאיבוד בקלות בחיידק שלך, או הולכים לאיבוד בתנאי לחץ, זו לא תהיה אפשרות מעשית. במקרים רבים, הפתרון הטוב ביותר יהיה לשלב את הכתב לבנות על גבי כרומוזום בקטריאלי, המאפשר תחזוקה יציבה של הכתב גם בהיעדר של בחירה. על מנת ששילוב לא לשבש את הביטוי או תקנה הרגיל של גן העניין שלך, אנו ממליצים לשלב לתוך אתר מחוץ לרחם בכרומוזום כי can לשמש "מוקד ניטראלי". בB. subtilis אתרי אינטגרציה אלה הם גנים ה– כאשר מוטציה – להעביר פנוטיפ בתקשורת מינימאלית מסוימת (המאפשר integrants להיות מזוהה ללא בחירת אנטיביוטיקה), אך אינו משנה את הצמיחה או שיעורים נביגה במדיה עשירה, וכולל כגון גנים כamyE, lacA, thrC, pyrD, gltA, וsacA (שינוע היכולת לנצל עמילן, β-galactosides, תראונין, אורציל, גלוטמט, וסוכרוז, בהתאמה) ^11-13.

למרות ששילוב בגנים אלה היה בשימוש באופן אמין במשך שנים רבות בB. subtilis (במיוחד בamyE וlacA), ידע דומה ייתכן שלא יהיה זמין לגנים במינים רבים של חיידקים אחרים. השימוש באתרים מצורפים הפאג חלופות גדולות לאתרי אינטגרציה כרומוזומליות ניטראליים: יש מינים ספציפיים רבים ^14-16, כמו גם באתרי אינטגרציה כלליים כגון האתר המצורף Tn7 (Tn7 עו"ד)זוהה ומנוצל להוספות גנים במינים רבים של חיידקי ^17,18.

חיידקים סביבתיים

אנו משתמשים באדמה כמקור ישיר של חיידקים סביבתיים למסך coculture שלנו. האדמה מכילה מגוון גבוה של חיידקים, ורבים מיצורים אלה הם מקור עשיר של מוצרים טבעיים. באמצעות תרחיפים נוזליים של אדמה הונחו ישירות על גבי צלחות עם הזן שלנו ניאון תעתיק כתב (ללא בידוד מוקדם של חיידקים מהאדמה), אנחנו מאוד לפשט הגישה הניסויית. האדמה יכולה לשמש מייד לאחר קציר, או להיות קפוא ב-80 ° C לשימוש עתידי. יש שימוש מיידי את היתרון שמגוון גדול יותר של חיידקים ניתן לגדל באופן פוטנציאלי, כולל אלה שלא ישרדו הקפאה היטב. יש לו את החסרון שהריכוז של אורגניזמים אדמה לעיבוד חקלאיים מדוגמאות אלה אינו ידוע, הגדלת מספר צלחות מסך שחייב להיות בשימוש. דליש שימוש עאיד היתרון ש/ מיליליטר CFU עבור כל מקור אדמה ניתן לקבוע מראש, ומאפשר למספר אופטימלי של מושבות שגדל על כל צלחת מסך. עם זאת, הוא דורש שאורגניזמים האדמה להיות מסוגלים לשרוד הקפאה.

שים לב שגיוון בריכת inducer הנבדקת (כלומר מקורות האדמה) מופיע להיות יעילים יותר בזיהוי אינטראקציות interspecies חדשים מאשר הקרנה מעמיקה על אותה האדמה: מגוון פילוגנטי גדול יותר נצפה בנפילות במסך מטריקס האינדוקציה שלנו, כמו מקורות אדמה נוספים נבדקו ולא הקרנה אותם מקורות הקרקע באופן יסודי יותר (EA שאנק ור 'Kolter, בית הספר לרפואה של אוניברסיטת הרווארד, תוצאות לא פורסמו).

סקירה

הגישה שאנו מתארים כאן היא פשוטה מבחינת הדרישות טכניות שלה. היא כוללת: 1) בניית כתב תעתיק ניאון בB. subtilis אומיני חיידקים אחרים של עניין, 2) זיהוי תנאים שבם הכתב הזה אינו מופעל, 3) הכנת aliquots של זן הכתב הזה ואורגניזמים שיוקרנו (במקרה של אדמתנו, אבל יכולים להיות מנוצלים מקורות אחרים במקום), 4) ערבוב אלה שתי קבוצות של חיידקים על תקשורת מוצקה, 5) זיהוי ובידוד המשוערת גרימת אורגניזמים, ו6) המאשר כי אורגניזמים אלה אכן להפעיל פנוטיפ זה במסך המשני. לאחר שזוהו, אורגניזמים אלה ומטבוליטים שלהם לספק לנו כלים כימיים כדי לווסת את התנהגות חיידקים, ללמוד פיזיולוגיה חיידקים ויחסי גומלין של חיידקים, ואפשרות לפעול פיגומי רומן כמו לתרכובות טיפוליות עתידיות.

Protocol

1. בחר גן כתב ולבנות כתב ניאון תעתיק לsubtilis ב: ראה מאמר יופיטר בהתייחסות 19 לפרוטוקול המתאר את הבנייה של כתבי תעתיק ניאון בsubtilis Bacillus. <p class="jove_content" style=";text-align:right;di…

Representative Results

מסך זה משמש לזיהוי אורגניזמים אדמה מפריש תרכובות המשנות את הפיסיולוגיה של B. subtilis. התוצאות המתוארות כאן יתמקדו בסוג התא שמייצר מטריצה ​​של B. subtilis, אשר מייצר את החלבון וexopolysaccharide הנדרשים ליצירת biofilm חזקה בחיידק זה. אנחנו בחרנו את האמרגן של אופרון טאפה-sipW-טס…

Discussion

אחת המגבלות הטבועות של הפרוטוקול הזה הוא שהוא מסתמך על cultivability של אורגניזמים מיקרוביאלי. כפי שכבר תעד ²⁴ היטב, רוב החיים מיקרוביאליים על פני כדור הארץ לא יכולים (עדיין) להיות מבוגרים בתנאי culturing נחקרו עד כה. לפיכך, מספר עצום של יחסי גומלין בין מינים של חיידקים המתר…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.