化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

Summary

細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。

Abstract

自然界では、細菌はほとんど単独で存在していない、彼らは代わりに代謝物を分泌することにより、ローカル環境を変更他の微生物の多様な囲まれています。これらの代謝産物は、その微生物の隣人の生理学および分化を調節する可能性があると思わ複雑な微生物群集の確立と維持に重要な要素である。我々はそのような化学的媒介微生物の相互作用を同定するために蛍光ベースの共培養画面を開発しました。画面には、固形培地上での環境微生物に蛍光転写レポーター株を組み合わせて、コロニーが共培養で増殖させることが含まれます。それは、目的の特定の表現型発現されたときに選択された細菌株が蛍光を発するように蛍光体転写レポーターに設計され（ すなわち、バイオフィルム形成、胞子形成、毒性因子の産生、等 。）スクリーニングは成長条件の下で行われるWHEこの表現型を再発現（したがって、レポーター株は、典型的には非蛍光性である）されない 。環境微生物がこの表現型を活性化する代謝産物を分泌する場合には、寒天を通って拡散し、蛍光レポーター構築物を活性化する。これは誘導代謝産物を産生する微生物を検出することができます：彼らは蛍光コロニーに最も近い非蛍光コロニーである。このように、この画面には、レポーター株の特定の生理的応答を活性化拡散性代謝​​物を生産する環境微生物の同定を可能にする。 a）に示すように、適切な共培養スクリーニング条件を選択B）スクリーニングのためのレポーターや環境微生物を準備し、c）の共培養画面を行い、D）推定誘導する生物を分離し、そしてe）二次スクリーニングにおいてその活性を確認する：この資料には、どのように説明します。私たちは、 枯草菌におけるバイオフィルムマトリックスの生産を活性化する土壌生物をスクリーニングするためにこの方法を開発した</EM>が、我々はまた、他の遺伝的に扱いやすい細菌にこの手法を適用するための考慮事項について説明します。

Introduction

私たちは、細菌が分泌する代謝物が隣接微生物の生理機能と発展にどのように影響するかを理解することに興味を持っています。多くの代謝物は、他の微生物に及ぼす生理活性効果のために特徴付けられている。 2つのよく記載の実施例は、他の微生物の全体的な遺伝子発現を変化させる他の微生物の増殖を阻害する抗生物質、およびクオラムセンシング分子が含まれる。しかし、細菌は既知の生物活性^1を持っていない他の多くの小分子の天然産物を生産する。私たちは、細菌が進化し、彼らは彼らがほとんどの細菌が存在し、その中の複雑な微生物群集での微生物の隣人の細胞生理を調節することができるため、これらの代謝物の一部を生産する能力を保っていると仮定した。

枯草菌細胞型

私たちは、Bacilを伴う化学的に媒介微生物の相互作用に関する我々の研究を集中してきたLUは枯草菌。これは、グラム陽性モデル細菌とその操作のために利用可能な結果の遺伝的なツールとしての地位を、だけでなく、ために特性の細胞種に分化する能力があるだけではありません。環境からDNAを取り込むことのできる、、堅牢なバイオフィルムの形成のために必要とされる細胞外マトリックスを産生する、水泳、その他²の中で、胞子形成：例としては、細胞が含まれる。これらの細胞型の各々は、それらの生理学的および/または物理的に別個のそれらの遺伝的に同一の兄弟からなる特徴的な転写レギュロンを発現する。多くの増殖条件下で、複数の細胞型は、B.の単一コロニー内のような種々の亜集団を共存枯草菌細胞 ^3。細菌の多くの種は、類似の細胞型の不均一性を示すことができるが、この現象は、特によくB.研究されている枯草菌 。

UPRであり、特に、遺伝子これらの特定のBの各々の中egulated 枯草菌細胞型が同定されている。興味のあるこれらの微生物の表現型の多くは、直接観察することが困難または不可能であるため、このようなアップレギュレートされた遺伝子を同定すること、ここで説明する研究に不可欠である。例えば、我々は、視覚的に、このような固体（1.5％）寒天プレート上で水泳など形質を検出できなくてもBの亜集団枯草菌細胞は、それらの条件の下で³鞭毛を生産する。別の例としては、バイオフィルムマトリックス生産です。行列の生産は（それが巨視的にしわコロニーになるように）コロニー形態により可視化だけ特定の増殖培地上、唯一の成長⁴の倍数日後にすることができます。しかし、分化の間にアップレギュレートされる遺伝子を知ることによって、私たちは、これらの細胞型への細胞分化のマーカーとして機能するの転写レポーターを構築することができます。

レポーター構築

これらの蛍光トンranscriptionalレポーターは、細胞型特異的遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、レポーター遺伝子の産生を駆動するためのプロモーターから成る。例としては、P _HAG-YFP（水泳細胞）、P _TAPA-YFP（バイオフィルムマトリックス産生細胞用）、およびP _xは遺伝子xのプロモーター領域を示すP _SSPB-YFP（細胞を胞子形成のための）が含まれる。表現型のネイティブ調節がそのまま残されているように、これらのレポーター構築物は、染色体上の中立座位（ 図1及び下記参照）に統合されています。細胞はこの表現型を発現しかし、今、それはまた、蛍光タンパク質を発現する。これは、私たちは、この生理学的応答を活性化する微生物をスクリーニングすることができ、特定の表現型の行動の活性化の容易に可視化読み出しを提供しています。このような記者は、一般的に微生物学で使用されているが、これらは広くidentifするスクリーニングに適用されていないこのメソッドの前に微生物間のY代謝相互作用は^5を説明した。

細胞型特異的レポーター株の設計と建設における重要な考慮事項がいくつかあります。構築物の他の種類は確かに可能であるが、我々は、排他的に転写蛍光レポーターを利用している。我々は2つ​​の理由のために、しかし、私たちの画面での細胞種分化のマーカーとして翻訳融合の使用を思いとどまら：非摂動天然の細胞型特異的タンパク質を残す1）意欲、および2）の認識、その拡散し、細胞広い蛍光は（翻訳融合と共通）、細胞内に局在涙点よりも検出が容易になります。

レポーター遺伝子の選択

読み出しなどの転写を使用することを決定した後、レポーター遺伝子（ 例えば LacZを、蛍光、またはルシフェラーゼ）を選択する必要があります。 lacZを少なくとも特別なを必要とするという利点がある検出するための設備を化されたが、環境微生物の中で偽陽性の非常に高い可能性がある。私たちの手では、土壌の微生物の中でラック⁺生物^のバックグラウンドレベルは、（;データは示していない>>土壌微生物の10％が、X-galプレート上で）ラック^+（青だった）法外に高かった。我々はこれをしようとしなかったが、それは、媒体中のX-galの濃度を滴定することによって、これはX-galをレポーターの使用を可能にするように最適化され得ることが可能である。ルシフェラーゼは、高い検出感度を提供し、最も直交レポーターである：環境微生物は、本質的に発光であることのほとんどない可能性があります。しかし、我々はそれが困難で大部分がマルチウェルプレートでのみ局所的な領域をスキャンするように設計されたように、全体のペトリプレートを横切って発光検出を可能にした我々の施設での器具類を同定することが見出さ。また、また、同時に、物理が許可された方法で、発光コロニーを可視化する合併症があるかもしれない誘導生物のオレーション。受託者を使用すると、これを可能にしたかもしれないが、我々は代わりにBで動作するように証明された蛍光の転写レポーターを使用することを選択枯草菌は 、検出と土壌生物の中で低い偽陽性率の十分な感度を提供し、可視化し、単離方法の両方で簡単に利用可能な機器の使用を許可。

蛍光団の選択

選択された特定のフルオロフォアは、あなたの細菌種は、使用している寒天増殖培地、および、利用可能な特定の蛍光フィルターセットに依存します。当社の計測機器では、我々が発見したBの両方枯草菌は自身とYFP（黄色蛍光タンパク質）フィルタが使用されたときには私たちの手の中にGFP（緑色蛍光タンパク質）へのレポーターは、優れた作り、展示少ないバックグラウンド蛍光上で増殖させた寒天コロニー。蛍光タンパク質のコドン使用頻度である頻繁にどちらかあなたの細菌種で機能するように、または構成的プロモーターを使用して明示的にテストするために文献から知られている蛍光体を選択することが重要に作り、真核生物のために最適化された。進化し続ける蛍光タンパク質変異体の大きな数は^6、現在利用可能であり、明示的に実験⁹の適切な蛍光タンパク質を選択するためのガイダンスを提供し、そのうちのいくつかのソース^7,8の数、で検討されている。

プロモーターの選択

プロモーターの選択は、主に携帯型または関心対象の表現型に依存するであろう。このようなBと生物の枯草菌 、いくつかの細胞型特異的レポーター遺伝子は、文献において確立されている。他の細菌株については、マイクロアレイまたは転写データを調べることは、関心iの携帯型遺伝子は高度な条件下でアップレギュレートされているかについての情報を提供することが必要であるSは明らか。最近の研究では、Bの転写をカタログ化タイリングマイクロアレイ^10を使用して、104の異なる増殖条件下ズブチリス 。本論文では、遺伝子は、高度にあまりよく特徴付けられた表現型のための非常に貴重である、異なる条件下でアップレギュレートされているかについての包括的な情報を提供します。

むしろ関心のある全ての遺伝子のための正確なプロモーター領域をマッピングするよりも、我々は一般的に、単純に、プロモーターとしての遺伝子の上流配列200〜500塩基対を使用しています。正確な配列の長さは、ゲノムの文脈に依存する：必要なオープンリーディングフレームの上流に隣接するコード領域を含む回避するときに短い領域が使用される。

中立座と統合

どのような細菌株においてレポーター構築物を維持するために蛍光転写レポーター株を設計する際の最後の質問になります。細菌では、関心対象の遺伝子が頻繁に維持される抗生物質の選択を使用してプラスミド上。しかしながら、環境微生物を殺すことなく共存時に抗生物質を使用できないことがあり得る。プラスミドを安定的にお使いの細菌種で維持している場合は、スクリーニングのために、あなたのレポーターを準備するための抗生物質の存在下でプラスミド由来のレポーターを含むあなたの細菌を成長した後、プラスミドは思いますが、共培養自体の間に、抗生物質を排除することが可能である十分な蛍光を可能にするために維持される。プラスミドは簡単に細菌中で失われているか、ストレス条件下で失われた場合は、これは実行可能な選択肢ではありません。多くの場合、最善の解決策であっても、選択の非存在下でのレポーターの安定な維持を可能にする細菌染色体上にレポーター構築物を統合することであろう。目的の遺伝子の正常な発現や規制を混乱しないようにする統合のためには、我々はカリフォルニア染色体上の異所性部位の中に統合することをお勧めしますNとして機能する「中立座。 " Bの枯草菌 、これらの組み込み部位が遺伝子であることを-変異したとき- （組込み体が抗生物質選択することなしに同定することができるように）特定の最小培地での表現型を伝え、まだリッチメディアの成長や胞子形成率を変更しない、とのamyE、LACAなどの遺伝子が含まれる、 thrC遺伝子、pyrD、gltA遺伝子、およびSACA（デンプンを利用する能力を搬送する、β-ガラクトシド、トレオニン、ウラシル、グルタミン酸塩、及びスクロース、それぞれ^）11-13。

これらの遺伝子における統合はB.に長年にわたって確実に使用されてきたが枯草菌 （特にのamyEとLACA時）、同じような知識は、他の多くの細菌種の遺伝子のために利用できない場合があります。ファージ結合部位の使用は、中立的な染色体組み込み部位に最適の選択肢である：多くの種特異的^14〜16、ならびにそのようなのTn7接着部位などの一般的な組み込み部位（ATTの Tn7転移）が持っている多くの細菌種^17,18で同定した遺伝子の挿入のために利用されて。

環境微生物

私達は私達の共培養画面の環境微生物の直接のソースとして土を使用しています。土壌微生物の高い多様性を含有し、これらの生物の多くは、天然物の豊富な供給源である。 （土壌からの細菌の事前の単離することなく）私たちの蛍光転写レポーター株にプレート上に直接置かれた土壌の液体懸濁液を使用することにより、我々は非常に実験的なアプローチを簡素化します。土壌は、収穫後直ちに使用することができる、又は将来の使用のために-80℃で凍結する。即時の使用は、微生物の大きな多様性は、潜在的にうまく凍結生存しないであろうものを含めて、成長させることができるという利点を有する。これは、使用しなければならないスクリーン板の数を増加させる、これらのサンプルから培養可能な土壌生物の濃度が不明であるという欠点を有する。デルayed使用が最適化されたコロニーの数は、各スクリーン版上に成長させることができるように、各土壌のソースcfu / mlでは、事前に決定することができるという利点を有する。しかし、土壌生物が凍結を存続できることが必要です。

デューサプールの多様化が検討されていることに注意してください（ すなわち土壌源）は、同じ土壌に関する詳細なスクリーニングよりも新しい種間相互作用を同定するのにより効果的であるように思われる。大きな系統発生多様性としてのマトリックスの誘導画面で同定されたヒットで観察された追加の土壌のソースは、（EAシャンクとR. Kolter、ハーバード大学医学部、未発表の結果）を調べたのではなく、より徹底的に、同じ土壌のソースをスクリーニングされた。

概要

我々はここで説明するアプローチは、その技術的要件の面で簡単です。それが含まれます。1）Bの蛍光転写レポーターを構築する枯草菌や関心のある他の細菌種、2）4）、これらを混合、）我々の場合の土壌中の（3）スクリーニングされるこのレポーター株と生物のアリコートを調製し、この記者が活性化されていない条件を特定したが、他のソースではなく、利用することができる固体培地上の微生物の二組、5）を同定および単離推定上の生物を誘導する、および6）これらの生物が実際に二次スクリーニングにおいて、この表現型を活性化しないことを確認した。一旦同定、これらの生物とその代謝物は、細菌の挙動を調節するために、細菌の生理学および微生物の相互作用を研究するために、潜在的に将来の治療用化合物のための新規な足場として作用する化学物質のツールを提供してくれる。

Protocol

1。レポーター遺伝子を選択し、蛍光転写レポーターを構築 枯草菌の場合： 枯草菌における蛍光の転写レポーターの構成を説明するプロトコルのためのリファレンス19 Joveの記事を参照してください。 他の細菌種の場合： 関心のある生理学的応答の間にアップレギュレートされる遺伝子を特定しま?…

Representative Results

この画面は、B.の生理機能を変化させる化合物を分泌する土壌生物を同定するために使用した枯草菌 。ここに記載の結果は、B.のマトリックス産生細胞型に焦点を当てるこの細菌における強固なバイオフィルムの形成のために必要とされるタンパク質とエキソポリサッカライドを生産菌 、。私たちは、蛍光レポーター構築物（P TAPA-YFP）のためTAPA-s…

Discussion

このプロトコルの固有の制限の一つは、微生物のcultivabilityに依存することである。よく^24を文書化してきたように、地球上で最も微生物の人生は（まだ）これまでに検討さ培養条件下で増殖させることができません。これにより、自然環境で発生している微生物種間の相互作用の膨大な数は、このアプローチを用いて検出されないであろう。私たちの願いは、このような相互作用の?…

Materials

Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Spectrophotometer			Any spectrophotomer capable of measuing OD600 absorbance values.
Luria broth, Lennox	VWR	80017-484	Alternative media sources may be necessary.
Glass beads, 3 mm	VWR	26396-508
Gel loading tips, round	VWR	29442-666
Glass rods	VWR	59060-069
Fluorescence dissecting stereoscope	Zeiss	N/A	The author used a Zeiss Stemi SV6 dissection stereoscope with an EXFO X-cite 120 fluorescent light source, a long-pass YFP filter cube, an achromat 0.63X objective, 10X eyepieces, and an Axio HRC HR digital camera. Most screening was done with the focusing mount at 2.0-3.2X. Any dissecting stereoscope with fluorescence capabilities is fine, provided you have the correct filters for the FP you are using. It is best if there is a shutter that allows you to easily switch between brightfield and fluorescense, as well as a stage that allows illumination from above and below. If you want to capture images, an attached camera is also necessary.