Brug af pHluorin til at vurdere dynamikken i Axon-vejledningsreceptorer i cellekultur og i chickembryoet
Summary
Vi beskriver her brugen af en pH-følsom grøn fluorescerende proteinvariant, pHluorin, til at studere spatio-tidsmæssig dynamik axon vejledning receptorer handel på celleoverfladen. Den pHluorin-mærkede receptor udtrykkes både i cellekultur og in vivoved hjælp af elektroporation af kyllingembryoet.
Abstract
Under udviklingen spiller axon-vejledningsreceptorer en afgørende rolle i reguleringen af axoners følsomhed over for både attraktive og frastødende signaler. Faktisk er aktivering af vejledningsreceptorerne det første trin i signalmekanismerne, der tillader axonspidser, vækstkeglerne, at reagere på liganderne. Som sådan er gradueringen af deres tilgængelighed på celleoverfladen en af de mekanismer, der deltager i fastsættelsen af vækstkeglernes følsomhed. Vi beskriver her en metode til præcist at visualisere spatio-temporal celleoverfladedynamik af en axon-vejledningsreceptor både in vitro og in vivo i den udviklende chick rygmarv. Vi udnyttede den pH-afhængige fluorescensegenskab for en grøn fluorescerende proteinvariant (GFP) til specifikt at detektere den brøkdel af axonvejledningsreceptoren, der er adresseret til plasmamembranen. Vi beskriver først in vitro-valideringen af sådanne pH-afhængige konstruktioner, og vi beskriver yderligere deres anvendelse in vivo, i chick spinal akkord, for at vurdere den spatio-tidsmæssige dynamik i axon-vejledningsreceptoren af interesse.
Introduction
Under deres navigation integrerer axoner flere miljømæssige signaler, der guider dem mod deres mål. Disse signaler aktiverer styrereceptorer på overfladen af axonterminaler, vækstkeglerne, som igen starter en passende signalvej. Således er den tidsmæssige og rumlige regulering af receptorernes celleoverfladefordeling afgørende for at indstille følsomheden af vækstkeglerne1. I denne sammenhæng er midterlinjeovergang med commissural axoner en fremragende model til at undersøge reguleringen af receptorcelleoverfladeniveauer. I den udviklende rygmarv tiltrækkes commissural axoner i første omgang mod den ventrale gulvplade, hvor de krydser midterlinjen. Efter krydsning mister de deres lydhørhed over for gulvpladens tiltrækningskraft og får respons på gulvpladeafvisende midler, så de kan forlade gulvpladen og navigere mod deres endelige destination i den kontralaterale side af nervesystemet2,3. Regulering af receptortilgængelighed på vækstkegleroverfladen er en af de mekanismer, der ligger til grund for skiftet af reaktionsevne til midterlinjesignaler4,5. Således er selektiv overvågning af de receptorer, der er til stede ved plasmamembranen af vækstkegler, af største betydning. Vi beskriver her en metode baseret på den pH-afhængige fluorescensegenskab af en grøn fluorescerende protein (GFP) variant til specifikt at visualisere axon-vejledningsreceptorerne, der er adresseret til plasmamembranen in vitro og in vivo, i den udviklende chick rygmarv.
Rothman og kolleger manipuleret af punkt mutationer pH-følsomme varianter af GFP herunder ekliptika pHluorin6. Ekliptisk pHluorin har den egenskab, at den ikke er fluorescerende, når den udsættes for sur pH (<6), samtidig med at den er fluorescerende ved neutral pH. Dette gør det muligt at skelne ikkefluorescerende receptorer, der er lokaliseret i intracellulære sure rum(dvs. endosomer, menneskehandelsvesikler) fra fluorescerende receptorer, der er indbygget i plasmamembranen og dermed udsat for den ekstracellulære neutrale pH7. Vi benyttede os af dette til at overvåge plasmamembranlokaliseringen af plexinA1, en axon-vejledningsreceptor, der formidler vækstkeglerresponsen på den midline-afvisende semaphorin 3B5 (Figur 1A). Vi beskriver her in vitro karakterisering af en pHluorin-plexinA1 konstruere, sammen med in ovo elektroporation8-10 af denne konstruktion i udviklingslandene chick rygmarv efterfulgt af mikroskopiske analyse af cryosections som gør det muligt at følge axon vejledning receptor dynamik in vivo med både rumlige og tidsmæssige opløsninger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol giver en trin-for-trin procedure for at følge dynamikken i en axon vejledning receptor både i cellekultur og i den udviklingsmæssige sammenhæng af chick embryo rygmarven.
For at designe et de novo pHluorin-mærket protein skal der tages hensyn til to punkter vedrørende kloningsstrategien. For det første bør pHluorin-mærket udsættes for lumen af de sure endosomer og dermed for det ekstracellulære rum for at visualisere plasmamembranreceptorpuljen. Den korrekte …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Homaira Nawabi, Frederic Moret og Isabelle Sanyas for deres hjælp. Dette arbejde understøttes af CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA til V.C.; C.D-B og A.J støttes af henholdsvis en La Ligue-contre le cancer og Labex DevWeCan-stipendier.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
Referências
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Bioquímica. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
