Hücre Kültüründe ve Civciv Embriyosunda Akson Kılavuz Reseptörlerinin Dinamiklerini Değerlendirmek için pHluorin Kullanımı
Summary
Hücre yüzeyindeki akson kılavuz reseptörlerinin mekansal-zamansal dinamiklerini incelemek için pH’a duyarlı yeşil floresan protein varyantı pHluorin’in kullanımını burada açıklıyoruz. pHluorin etiketli reseptör hem hücre kültüründe hem de in vivoolarak ifade edilir Civciv embriyosunun elektroporasyonunu kullanarak.
Abstract
Geliştirme sırasında, akson kılavuz reseptörleri, aksonların hem çekici hem de itici ipuçlarına duyarlılığını düzenlemede çok önemli bir rol oynar. Gerçekten de, kılavuz reseptörlerinin aktivasyonu, akson uçlarının, büyüme konilerinin ligandlara yanıt vermesine izin veren sinyal mekanizmalarının ilk adımıdır. Bu nedenle, hücre yüzeyindeki kullanılabilirliklerinin modülasyonu, büyüme konisi duyarlılığının ayarlanmasına katılan mekanizmalardan biridir. Burada, gelişmekte olan civciv omurilikte hem in vitro hem de in vivo bir akson kılavuz reseptörün mekansal-zamansal hücre yüzey dinamiklerini tam olarak görselleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Plazma zarına hitap eden akson kılavuz reseptörünün fraksiyonunu özellikle tespit etmek için yeşil floresan protein (GFP) varyantının pH’a bağımlı floresan özelliğinden yararlandık. İlk olarak bu tür pH’a bağımlı yapıların in vitro doğrulamasını açıklıyoruz ve akson kılavuz reseptörün mekansal-zamansal dinamiklerini değerlendirmek için in vivo, civciv omurilik akorunda kullanımlarını daha ayrıntılı olarak açıklıyoruz.
Introduction
Navigasyonları sırasında, aksonlar onları hedeflerine yönlendiren birden fazla çevresel ipucu entegre eder. Bu ipuçları, axon terminallerinin yüzeyindeki kılavuz reseptörlerini, büyüme konilerini aktive eder ve bu da uygun bir sinyal yolu başlatır. Bu nedenle, reseptörlerin hücre yüzey dağılımının zamansal ve mekansal regülasyonu, büyüme konisinin hassasiyetini ayarlamak için kritik öneme sahiptir1. Bu bağlamda, kommissural aksonlar tarafından orta çizgi geçişi, reseptör hücre yüzey seviyelerinin düzenlenmesini araştırmak için mükemmel bir modeldir. Gelişen omurilikte, kommissural aksonlar başlangıçta orta çizgiyi geçtikleri ventral zemin plakasına doğru çekilir. Geçtikten sonra, zemin plakası çekicilerine yanıtlarını kaybederler ve zemin plakası kovuculara yanıt kazanırlar, böylece zemin plakasından çıkabilirler ve sinir sisteminin karşıt tarafında son hedeflerine doğru gidebilirler2,3. Büyüme konisi yüzeyinde reseptör kullanılabilirliğinin düzenlenmesi, yanıt vermenin orta hat ipuçlarına geçişinin altında kalan mekanizmalardan biridir4,5. Bu nedenle, büyüme konilerinin plazma zarında bulunan reseptörlerin seçici izlenmesi birincil öneme sahiptir. Burada, gelişmekte olan civciv omuriliğinde plazma zarı in vitro ve in vivoyahitap eden akson kılavuz reseptörlerini özellikle görselleştirmek için yeşil bir floresan protein (GFP) varyantının pH’a bağımlı floresan özelliğine dayanan bir yöntemi açıklıyoruz.
Rothman ve meslektaşları, ekliptik pHluorin 6 da dahil olmak üzere GFP’nin nokta mutasyonları pH’a duyarlı varyantları tarafındantasarlanmıştır. Ekliptik pHluorin, asidik pH’a (<6) maruz kaldığında, nötr pH'da floresan iken, nonfluorescent olma özelliğine sahiptir. Bu, hücre içi asidik bölmelerde lokalize olan nonfluoresan reseptörlerin(yani endozomlar, kaçakçılık veziklinleri) plazma membranına dahil edilen floresan reseptörlerden ayırt etmesine ve böylece hücre dışı nötr pH7’yemaruz kalmalarına izin verir. Orta hat kovucu semaforin 3B5’e (Şekil 1A)büyüme konisi tepkisine aracılık eden bir akson kılavuz reseptörü olan pleksinA1’in plazma membran lokalizasyonunu izlemek için bundan yararlandık. Burada, gelişmekte olan civciv omuriliğinde bu yapının8-10 no’luk ovo elektroporasyonunun yanı sıra bir pHluorin-pleksinA1 yapının in vitro karakterizasyonunu ve ardından hem mekansal hem de zamansal çözünürlüklerle akson kılavuz reseptör dinamiklerini in vivo olarak takip etmeyi sağlayan kriyoseksiyonların mikroskobik analizini açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, hem hücre kültüründe hem de civciv embriyo omuriliğinin gelişimsel bağlamında bir akson kılavuz reseptörü dinamiklerini takip etmek için adım adım bir prosedür sağlar.
Bir de novo pHluorin etiketli protein tasarlamak için klonlama stratejisi ile ilgili iki noktanın göz önünde bulundurulması gerekir. İlk olarak, pHluorin etiketi, plazma membran reseptör havuzunu görselleştirmek için asidik endozomların lümenine ve dolayısıyla hücre dışı b…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yardımları için Homaira Nawabi, Frederic Moret ve Isabelle Sanyas’a teşekkür ederiz. Bu çalışma CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C. C.D-B ve A.J, sırasıyla La Ligue contre le cancer ve Labex DevWeCan bursları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
Referências
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Bioquímica. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
