استخدام pHluorin لتقييم ديناميات مستقبلات الإرشاد أكسون في زراعة الخلايا وفي الجنين الفرخ
Summary
ونصف هنا استخدام متغير البروتين الفلوري الأخضر الحساس ل درجة الحموضة، وهو pHluorin، لدراسة الديناميات الزمانية للبصق لمستقبلات توجيه المحور العصبي التي تتاجر على سطح الخلية. يتم التعبير عن مستقبلات pHluorin الموسومة في كل من زراعة الخلايا وفي الجسم الحي، باستخدام الكهرومporation من جنين الفرخ.
Abstract
أثناء التطوير ، تلعب مستقبلات التوجيه المحوري دورا حاسما في تنظيم حساسية المحاور للإشارات الجذابة والبغيضة على حد سواء. في الواقع ، تفعيل مستقبلات التوجيه هو الخطوة الأولى من آليات الإشارات التي تسمح نصائح المحور المحور ، والمخاريط النمو ، للرد على ligands. على هذا النحو، وتعديل توافرها على سطح الخلية هي واحدة من الآليات التي تشارك في وضع حساسية مخروط النمو. نحن نصف هنا طريقة لتصور بدقة ديناميات سطح الخلية الصدغية من مستقبلات التوجيه المحوري على حد سواء في المختبر وفي الجسم الحي في الحبل الشوكي الفرخ النامية. لقد استفدنا من خاصية الفلورية المعتمدة على الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) للكشف على وجه التحديد عن جزء مستقبلات توجيه المحور الذي يتم توجيهه إلى غشاء البلازما. نحن أول وصف التحقق من صحة في المختبر من هذه البنى التي تعتمد على الحموضة ونحن مزيد من التفصيل استخدامها في الجسم الحي، في وتر العمود الفقري الفرخ ، لتقييم ديناميات spatio الزمنية لمستقبلات التوجيه المحورية من الفائدة.
Introduction
أثناء الملاحة، تدمج المحاور إشارات بيئية متعددة توجهها نحو هدفها. هذه الإشارات تنشيط مستقبلات التوجيه على سطح محطات المحور، والمخاريط النمو، والتي بدورها بدء مسار الإشارات المناسبة. وهكذا، فإن التنظيم الزمني والمكاني لتوزيع سطح الخلية من المستقبلات أمر بالغ الأهمية لضبطحساسية مخروطالنمو 1 . في هذا السياق، عبور خط الوسط بواسطة محاور المحور commissural هو نموذج ممتاز للتحقيق في تنظيم مستويات سطح الخلية مستقبلات. في الحبل الشوكي النامي ، تنجذب المحاور المفوضة في البداية نحو لوحة الأرضية البطنية حيث تعبر خط الوسط. بعد العبور ، يفقدون استجابتهم لمجذبات لوحة الأرضية ويكتسبون استجابة لطاردات لوحة الأرضية حتى يتمكنوا من الخروج من لوحة الأرضية والتنقل نحو وجهتهم النهائية في الجانب المقابل من الجهاز العصبي2،3. تنظيم توافر مستقبلات على سطح مخروط النمو هي واحدة من الآليات الكامنة وراء التحول من الاستجابة إلى العظة خط الوسط4,5. وهكذا، الرصد الانتقائي للمستقبلات الموجودة في غشاء البلازما من المخاريط النمو هو من الأهمية بمكان. نحن نصف هنا طريقة تستند إلى خاصية الفلورية المعتمدة على الرقم الحموضة لمتغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) لتصور مستقبلات توجيه المحور المحوري التي يتم توجيهها إلى غشاء البلازما في المختبر وفي الجسم الحي، في الحبل الشوكي الفرخ النامي.
روثمان وزملاؤه هندستها نقطة الطفرات المتغيرات الحساسة لHP من GFP بما في ذلك pHluorin الكسوف6. PHluorin Ecliptic لديه خاصية كونها غير فلورية عندما تتعرض لhh الحمضية (<6)، في حين يجري الفلورسنت في درجة الحموضة محايدة. وهذا يسمح التمييز بين مستقبلات nonfluorescent المترجمة في المقصورات الحمضية داخل الخلايا(أي الاندوسومات، والاتجار الحويصلات) من مستقبلات الفلورسنت أدرجت في غشاء البلازما وبالتالي تتعرض لHH محايدة خارج الخلية7. لقد استفدنا من ذلك لمراقبة توطين غشاء البلازما من plexinA1 ، وهو مستقبل توجيه محور التوسط استجابة مخروط النمو لطارد خط الوسط سيمافورين 3B5 (الشكل 1A). نحن نصف هنا التوصيف المختبري لبناء pHluorin-plexinA1 ، جنبا إلى جنب مع في ovo electroporation8-10 من هذا البناء في الحبل الشوكي الفرخ النامية تليها التحليل المجهري للخلايا المبردة التي تمكن من اتباع ديناميات مستقبلات التوجيه المحوري في الجسم الحي مع كل من القرارات المكانية والزمنية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول إجراء خطوة بخطوة لمتابعة ديناميكيات مستقبلات توجيه المحور في كل من زراعة الخلايا وفي السياق التنموي للنخاع الشوكي للجنين الفرخ.
لتصميم بروتين دي نوفو pHluorin الموسومة، هناك نقطتين تحتاج إلى النظر فيما يتعلق باستراتيجية الاستنساخ. أولا، يجب أن تتعرض ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونشكر هوميرا نوابي وفريدريك موريت وإيزابيل سانياس على مساعدتهم. ويدعم هذا العمل من قبل CNRS، جمعية فرانسيز contre ليه Myopathies (AFM)، ANR YADDLE، لابيكس DevWeCan، لابكس القشرة، ERC يودا إلى V.C. يتم دعم C.D-B و A.J من قبل La Ligue contre le cancer وزمالات Labex DevWeCan على التوالي.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
Referências
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Bioquímica. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
