Uso de pHluorin para avaliar a dinâmica dos receptores de orientação de axônio na cultura celular e no embrião de filhotes
Summary
Descrevemos aqui o uso de uma variante de proteína fluorescente verde sensível ao pH, pHluorin, para estudar a dinâmica espátula-temporal dos receptores de orientação de axônio que traficam na superfície celular. O receptor com marca de phluorina é expresso tanto na cultura celular quanto in vivo,usando eletroporação do embrião de filhote.
Abstract
Durante o desenvolvimento, os receptores de orientação do axônio desempenham um papel crucial na regulação da sensibilidade dos axônios a pistas atraentes e repulsivas. De fato, a ativação dos receptores de orientação é o primeiro passo dos mecanismos de sinalização que permitem pontas de axônio, os cones de crescimento, para responder aos ligantes. Como tal, a modulação de sua disponibilidade na superfície celular é um dos mecanismos que participam na definição da sensibilidade do cone de crescimento. Descrevemos aqui um método para visualizar precisamente a dinâmica da superfície celular espócica de um receptor de orientação de axônio tanto in vitro quanto in vivo na medula espinhal do pintinho em desenvolvimento. Aproveitamos a propriedade de fluorescência dependente do pH de uma variante de proteína fluorescente verde (GFP) para detectar especificamente a fração do receptor de orientação do axônio que é endereçado à membrana plasmática. Primeiro descrevemos a validação in vitro de tais construtos dependentes de pH e detalhamos ainda mais seu uso in vivo, na corda vertebral do pintinho, para avaliar a dinâmica espátula-temporal do receptor de orientação do axônio de interesse.
Introduction
Durante sua navegação, os axônios integram várias pistas ambientais que os guiam em direção ao seu alvo. Essas pistas ativam receptores de orientação na superfície dos terminais de axônio, os cones de crescimento, que por sua vez iniciam uma via de sinalização apropriada. Assim, a regulação temporal e espacial da distribuição da superfície celular dos receptores é fundamental para definir a sensibilidade do cone de crescimento1. Neste contexto, a travessia midline por axônios comissural é um excelente modelo para investigar a regulação dos níveis de superfície das células receptoras. Na medula espinhal em desenvolvimento, os axônios comissural são inicialmente atraídos para a placa do piso ventral onde cruzam a linha média. Após a travessia, eles perdem sua capacidade de resposta aos atrativos da placa de piso e ganham resposta aos repelentes da placa de piso para que possam sair da placa do chão e navegar em direção ao seu destino final no lado contralateral do sistema nervoso2,3. A regulação da disponibilidade do receptor na superfície do cone de crescimento é um dos mecanismos subjacentes à mudança de responsividade para as pistas de linha média4,5. Assim, o monitoramento seletivo dos receptores presentes na membrana plasmática dos cones de crescimento é de grande importância. Descrevemos aqui um método baseado na propriedade de fluorescência dependente do pH de uma variante de proteína fluorescente verde (GFP) para visualizar especificamente os receptores de orientação do axônio que são abordados à membrana plasmática in vitro e in vivo,na medula espinhal do pintinho em desenvolvimento.
Rothman e colegas projetados por mutações pontuais de variantes sensíveis ao PH do GFP, incluindo o pHluorin eclíptico6. A pHLuorina eclíptica tem a propriedade de não ser fluorescente quando exposta ao pH ácido (<6), enquanto é fluorescente em pH neutro. Isso permite distinguir receptores não fluorescentes localizados em compartimentos ácidos intracelulares (ou seja, endosários, vesículas de tráfico) de receptores fluorescentes incorporados à membrana plasmática e, assim, expostos ao pH neutro extracelular7. Aproveitamos isso para monitorar a localização da membrana plasmática do plexinA1, um receptor de orientação de axônio mediando a resposta do cone de crescimento à semaforina repelente midline 3B5 (Figura 1A). Descrevemos aqui a caracterização in vitro de uma construção pHluorin-plexinA1, juntamente com a eletroporação ovo8-10 deste construto na medula espinhal do filhote em desenvolvimento seguido pela análise microscópica de criosections que permitem acompanhar a dinâmica do receptor de orientação de axônio in vivo com resoluções espaciais e temporais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo fornece um procedimento passo-a-passo para acompanhar a dinâmica de um receptor de orientação de axônio tanto na cultura celular quanto no contexto de desenvolvimento da medula espinhal do embrião de filhotes.
Para projetar uma proteína marcada por novo pHluorin, dois pontos precisam ser considerados em relação à estratégia de clonagem. Primeiro, a etiqueta de pHluorin deve ser exposta ao lúmen dos endosários ácidos e, consequentemente, ao compartimento ext…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Homaira Nawabi, Frederic Moret e Isabelle Sanyas pela ajuda. Este trabalho é apoiado pela CNRS, Association Francaise contre les Myopathies (AFM), ANR YADDLE, Labex DevWeCan, Labex Cortex, ERC YODA to V.C.; C.D-B e A.J são apoiados por uma bolsa la Ligue contre le cancer e Labex DevWeCan, respectivamente.
Materials
| COS7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| DMEM GlutaMAX | GIBCO | 61965-026 | |
| Sodium pyruvate | GIBCO | 11360-039 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO | 10270-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Exgen500 reagent | Euromedex Fermentas | ET0250 | |
| PBS -Ca2+ -Mg2+ | GIBCO | 14190-094 | |
| Fast green dye | Sigma | F7252 | |
| 32% Paraformaldehyde aqueous solution | Electron Microscopy | 15714-S | Dilute extemporaneously in PBS to achieve a 4% solution |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7041 | |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Cryomount | Histolab | 00890 | |
| Hoechst 34580 | Invitrogen | H21486 | |
| Mowiol 4-88 | Fluka | 81381 | |
| Consumables | |||
| Bottom-glass 35 mm dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | |
| 5 ml Syringe | Terumo | SS-05S | |
| Needles 0.9 mm x 25 mm | Terumo | NN-2025R | |
| Capillaries | CML | PP230PO | capillaries are stretched manually in the flame |
| Superfrost Plus Slides | Thermo Scientific | 4951PLUS | |
| Material | |||
| Curved scissors | FST | 129-10 | |
| Microscalpel | FST | 10316-14 | |
| Forceps | FST | Dumont #5 REF#11254 | |
| Equipment/software | |||
| Time lapse microscope | Zeiss | Observer 1 | |
| Temp module S | PECON for Zeiss | ||
| CO2 module S | PECON for Zeiss | ||
| Metamorph software | Metamorph | ||
| Eggs incubator | Sanyo | MIR154 | |
| Electroporator apparatus | Nepa Gene CO., LTD | CUY21 | |
| Electrodes | Nepa Gene CO., LTD | CUY611P7-4 | 4 mm platinum electrodes |
| Fluorescence stereomicroscope | LEICA | MZ10F | |
| Cryostat | MICROM | HM550 | |
| Confocal microscope | Olympus | FV1000, X81 | |
| Fluoview software | Olympus | ||
| CLC Main Workbench software | CLC Bio | ||
Referências
- Winckler, B., Mellman, I. Trafficking guidance receptors. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, (2010).
- Jacob, T. C., et al. . J. Neurosci. 25, 10469-10478 (2005).
- Nawabi, H., Castellani, V. Axonal commissures in the central nervous system: how to cross the midline. Cell Mol. Life Sci. 68, 2539-2553 (2011).
- Keleman, K., Ribeiro, C., Dickson, B. J. Comm function in commissural axon guidance: cell-autonomous sorting of Robo in vivo. Nat. Neurosci. 8, 156-163 (2005).
- Nawabi, H., et al. A midline switch of receptor processing regulates commissural axon guidance in vertebrates. Genes Dev. 24, 396-410 (2010).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Miesenbock, G. Synapto-pHluorins: genetically encoded reporters of synaptic transmission. Cold Spring Harb. Protoc.. 2012, 213-217 (2012).
- Avraham, O., Zisman, S., Hadas, Y., Vald, L., Klar, A. Deciphering axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the chick neural tube utilizing in ovo electroporation. J. Vis. Exp. (39), 1792-17 (2010).
- Blank, M. C., Chizhikov, V., Millen, K. J. In ovo electroporations of HH stage 10 chicken embryos. J. Vis. Exp. (9), (2007).
- Wilson, N. H., Stoeckli, E. T. In ovo electroporation of miRNA-based plasmids in the developing neural tube and assessment of phenotypes by DiI injection in open-book preparations. J. Vis. Exp. (68), (2012).
- Rohm, B., Ottemeyer, A., Lohrum, M., Puschel, A. W. Plexin/neuropilin complexes mediate repulsion by the axonal guidance signal semaphorin 3A. Mech. Dev. 93, 95-104 (2000).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Dev. Dyn.. 195, 231-272 (1992).
- Korn, M. J., Cramer, K. S. Windowing chicken eggs for developmental studies. J. Vis. Exp. (8), (2007).
- Alberts, P., et al. Cdc42 and actin control polarized expression of TI-VAMP vesicles to neuronal growth cones and their fusion with the plasma membrane. Mol. Biol. Cell. 17, 1194-1203 (2006).
- Perret, E., Lakkaraju, A., Deborde, S., Schreiner, R., Rodriguez-Boulan, E. Evolving endosomes: how many varieties and why. Curr. Opin. Cell Biol. 17, 423-434 (2005).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J. Vis. Exp. (69), (2012).
- Tojima, T., Itofusa, R., Kamiguchi, H. Asymmetric clathrin-mediated endocytosis drives repulsive growth cone guidance. Neuron. 66, 370-377 (2010).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J. Vis. Exp. (54), 3024-30 (2011).
- Falk, J., et al. Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus. BMC Dev. Biol. 7 (107), (2007).
- Holzhausen, L. C., Lewis, A. A., Cheong, K. K., Brockerhoff, S. E. Differential role for synaptojanin 1 in rod and cone photoreceptors. J. Comp. Neurol. 517, 633-644 (2009).
- Shang, Y., Claridge-Chang, A., Sjulson, L., Pypaert, M., Miesenbock, G. Excitatory local circuits and their implications for olfactory processing in the fly antennal lobe. Cell. 128, 601-612 (2007).
- Dittman, J. S., Kaplan, J. M. Factors regulating the abundance and localization of synaptobrevin in the plasma membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11399-11404 (2006).
- Bozza, T., McGann, J. P., Mombaerts, P., Wachowiak, M. In vivo imaging of neuronal activity by targeted expression of a genetically encoded probe in the mouse. Neuron. 42, 9-21 (2004).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nat. Cell. Biol. 2, 197-204 (2000).
- Stark, D. A., Kasemeier-Kulesa, J. C., Kulesa, P. M. Photoactivation cell labeling for cell tracing in avian development. CSH Protoc.. 2008, (2008).
- Hildick, K. L., Gonzalez-Gonzalez, I. M., Jaskolski, F., Henley, J. M. Lateral diffusion and exocytosis of membrane proteins in cultured neurons assessed using fluorescence recovery and fluorescence-loss photobleaching. J. Vis. Exp. (60), (2012).
- Hanson, G. T., et al. Green fluorescent protein variants as ratiometric dual emission pH sensors. 1. Structural characterization and preliminary application. Bioquímica. 41, 15477-15488 (2002).
- Rose, T., Schoenenberger, P., Jezek, K., Oertner, T. G. Developmental refinement of vesicle cycling at schaffer collateral synapses. Neuron. 77, 1109-1121 (2013).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat. Neurosci. 15, 1047-1053 (2012).
- de Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons. J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).
