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Bioengineering

Establecimiento de un modelo quirúrgicamente inducida en ratones para investigar el papel de protección de progranulina en la osteoartritis

Published: February 25, 2014 doi: 10.3791/50924
Automatic Translation
1, 1, 2
1Department of Orthopaedic Surgery, NYU Hospital for Joint Diseases, 2Department of Orthopaedic Surgery, New York University Medical Center

Summary

Se describe un protocolo para la desestabilización del menisco medial modelo (DMM) en ratones, una herramienta eficaz para la osteoartritis (OA) de la investigación. Además, hemos demostrado que la deficiencia de desarrollo progranulincan OA exagera y la progresión mediante el uso de este modelo, lo que indica que progranulina juega un papel protector en la patogénesis de la OA.

Abstract

La desestabilización del menisco medial modelo (DMM) es una herramienta importante para el estudio de las funciones fisiopatológicas de numerosas moléculas asociadas con artritis en la patogénesis de la osteoartritis (OA) in vivo. Sin embargo, la detallada, especialmente el protocolo visualizado para establecer este modelo complicado en ratones, no está disponible. Aquí nos aprovechamos de tipo salvaje y progranulina (PGRN) - / - ratones como ejemplos de introducir un protocolo para inducir modelo DMM en ratones, y se comparó la aparición de OA después del establecimiento de este modelo inducida quirúrgicamente. Las operaciones realizadas en los ratones eran o simulacro de operación, que acaba de abrir la cápsula articular, o la operación DMM, que cortó el ligamento menisco tibial y causó la desestabilización del menisco medial. Severidad osteoartritis se evaluó usando el ensayo histológico (por ejemplo, tinción de safranina O), las expresiones de genes asociados a la OA, la forma de degradación del cartílago moléculas de la matriz extracelular, y osteofitosción. Operación DMM indujo con éxito la iniciación y la progresión de la OA en tanto de tipo salvaje y PGRN-/ - ratones, y la pérdida de factor de crecimiento PGNR dado lugar a un fenotipo más grave en la OA este modelo inducida quirúrgicamente.

Introduction

La osteoartritis (OA), también conocida como artritis degenerativa, afecta al 15% de la población mundial y más de 46 millones de personas dentro de los Estados Unidos, y se caracteriza por una sinovitis, la degeneración del cartílago y formación de osteofitos 1. Puede ser el resultado de una interacción compleja de factores genéticos, metabólicos, biomecánicas y bioquímicas. Los mecanismos subyacentes de la OA continúan para evadir la comunidad científica. Actualmente existen numerosos modelos animales que pueden imitar la patogénesis de la OA 2,3. Es importante establecer modelos animales en ratones tanto por la disponibilidad de varios ratones modificados genéticamente y la rentabilidad de la experimentación. Entre los diferentes tipos de modelos experimentales de OA, la desestabilización inducida quirúrgicamente de menisco medial modelo (DMM) es un modelo bien aceptado OA-debido a su buena reproducibilidad y una progresión relativamente más lenta durante el desarrollo de la OA. Ambos atributos tienensido clave para la evaluación de la progresión de la OA en diferentes tratamientos o transgenes 3-8. Sin embargo, la consistencia de OA modelo quirúrgico se ve afectada por varios factores durante la cirugía y como resultado, la aplicación de modelo de ratón quirúrgica está limitado.

Progranulina (PGRN) es un factor de crecimiento multifuncional expresado en varias células. Se sabe que PGRN desempeña un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos y patológicos tales como la cicatrización de heridas 9, la tumorigénesis 10, y la inflamación 11-15. Los estudios también muestran que la insuficiencia de PGRN puede causar enfermedades degenerativas del sistema nervioso en los seres humanos y los ratones 16-18. Se sabe que PGRN se expresa en el cartílago articular humano, y su nivel es significativamente elevado en el cartílago de pacientes con OA y la artritis reumatoide 19. Además, PGRN también juega un papel crucial en la proliferación de condrocitos 20, diferenciación y endocondralosificación del cartílago de crecimiento durante el desarrollo 21,22. Recientemente, se informó de que PGRN antagoniza el TNF-α a través de la unión a los receptores de TNF y exhibió una función anti-inflamatoria en modelos de artritis inflamatorias 13,14,23,24. Sin embargo, el papel de PGRN en la OA, especialmente in vivo, sigue siendo un enigma. Aquí, se presenta el procedimiento para inducir un modelo DMM quirúrgica, e investigar el papel de PGRN en el desarrollo de OA a través del establecimiento del modelo DMM en WT y PGRN-/ - ratones.

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Protocol

Todos los procedimientos quirúrgicos relacionados con los animales debe ser aprobado por el Cuidado de Animales y el Comité de Ética de la institución local con un esfuerzo realizado para minimizar el dolor y la incomodidad causada por la cirugía.

1. Preparación

  1. Seleccionar 8-12 semanas de edad macho C57BL / 6 ratones con un peso corporal de aproximadamente 25 g para la cirugía.
  2. Se anestesia a los animales mediante la inyección intraperitoneal de un cóctel que contiene tanto xilazina (5 mg / kg) y ketamina (40 mg / kg).
  3. Afeitado de la rodilla con las maquinillas de afeitar, a continuación, cuelgue quirúrgicamente el animal y esterilizar el sitio quirúrgico con betadine y alcohol (3x) y cubrir los ojos del ratón con el ungüento.

2. Proceso quirúrgico

  1. Hacer un 1 cm de la incisión longitudinal medial para-patelar para exponer articulación de la rodilla.
  2. Abra la articulación de la rodilla suavemente a través de la luxación lateral de la rótula y el tendón rotuliano.
    1. Cortar la cápsula de la articulación de la rodilla longitudinalmentea través de la incisión medial para-patelar en el paso 2.1.
    2. Diseccionar cápsula articular de la rodilla con una pinza.
    3. Coge la parte distal de la pata trasera con la mano izquierda, y le realizará luxación lateral de la rótula y el tendón rotuliano con fórceps. Sostenga la pata trasera con cuidado y asegúrese de evitar el trauma en la pata. Cuanto mejor sea la cápsula de la articulación se disecciona, se requiere menos fuerza para hacer que la dislocación.
  3. Por goteo de solución salina estéril en la superficie del cartílago articular durante la operación para evitar la desecación de la superficie del cartílago.
  4. Cortar el ligamento medial meniscotibial que ancla menisco medial de la meseta tibial. Evitar lesiones en el cartílago debajo del menisco medial.
    1. Identificar el menisco medial que se localiza entre el cóndilo medial del fémur y la meseta medial de la tibia.
    2. Identificar el ligamento que conecta meniscotibial lado lateral del menisco medial con eminencia intercondílea de la tibia.
    3. Sostenga la hiND pata suavemente con la mano, y cortar a través del ligamento meniscotibial medial cuidadosamente mediante el uso de una cuchilla quirúrgica N º 10. Asegúrese de no causar herir al cartílago articular y otros ligamentos. En muchos casos, la almohadilla de grasa que cubre necesita ser tirada hacia el lado, pero no ser retirado con el fin de identificar el ligamento.
  5. Cierre la cápsula de la articulación de la rodilla con una sutura absorbible 6-0.
  6. Cierre la piel con sutura de seda 6-0.

3. Cuidados después de la operación

  1. Aplicar una gota de 0,25% de bupivacaína en el sitio quirúrgico de cada ratón para minimizar el dolor post-operatorio.
  2. Deje los ratones operados gratis para conseguir agua y comida.

4. Scoring histológico de Surgical Modelo DMM

  1. Sacrificar los ratones en los puntos indicados de tiempo (por ejemplo, 4 semanas, 8 semanas y 12 semanas. Aquí mostramos los resultados de 8 semanas como representante) después de la cirugía.
  2. Las articulaciones de la rodilla enteras son fijos, descalcificada, embedded por parafina y luego realizaron cortes seriados 5 intervalo de micras.
    1. Cortar todo los miembros posteriores con N º 10 cuchillas.
    2. Diseccionar la piel y los músculos de las extremidades traseras cuidadosamente, y fijar las muestras con 4% PFA durante 3 días en RT.
    3. Retire la PFA, y limpiar las muestras con agua. Después, las muestras descalcificar en EDTA a 4 ° C durante 2 semanas.
    4. Deshidratar las muestras en un gradiente de etanol. En detalle, mantener las muestras en etanol al 70% durante 1 hora, a continuación, cambiar el etanol y mantener las muestras en un nuevo conjunto de etanol al 70% para el S / N. Después, poner las muestras en el 80% y etanol al 90%, en consecuencia, y mantenerlos durante 1 hora, respectivamente, seguido de etanol al 100% para el S / N.
    5. Retire el etanol. Mantener las muestras en oxylene durante 1 hora, y el cambio a un nuevo conjunto de oxylene. Repita este paso 3x.
    6. Incorporar las muestras en un molde de parafina utilizando el centro de la incrustación de Leica. Después, las muestras se seccionaron a 5 micras usando un micrótomo rotatorio (Leica RM2255, Alemania) y después se recogieron en portaobjetos de vidrio.
    7. Secciones sagitales en serie se cortan para cada muestra que abarca una región desde el centro del cóndilo lateral al centro del cóndilo medial.
  3. Tinción de safranina O se realiza, seguido de puntuación y análisis estadístico a través del sistema de puntuación OARSI lo descrito previamente 25.
    1. En primer lugar, Desparafinar las diapositivas en oxylene, e hidratar en un gradiente de etanol a agua destilada. Posteriormente, los portaobjetos se tiñen mediante hematoxilina de Weigert solución, 0,05% verde rápido (FCF) de soluciones, solución al 1% de ácido acético y 0,1% Solución de safranina O. Montar las diapositivas utilizando medio resinoso.
    2. Puntuación de los portaobjetos con tinción de safranina O basado en la pérdida de proteoglicanos (color rojo) en el cartílago y el porcentaje de destrucción de la estructura del cartílago, hacer el análisis estadístico para la puntuación histológica.

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Representative Results

Modelo DMM se estableció con éxito en ratones, y la deficiencia de PGRN exagerado desarrollo OA inducida quirúrgicamente.

Sham y DMM operaciones (Figura 1) se realizaron en WT y PGRN-/ - ratones. 8 semanas después de la operación, los ratones fueron sacrificados, y la tinción de safranina O se realizó en las secciones de las articulaciones de rodilla, seguidos por análisis estadístico de la puntuación de artritis basada en la histología. Como se muestra en la Figura 2A, no había degeneración evidente de cartílago en ambos genotipos en los grupos de operación simulada basada en la tinción de safranina O, lo que implicaba las condiciones iniciales similares (paneles superiores). 8 semanas después de la operación DMM (paneles inferiores), se produjo la pérdida de proteoglicanos y la destrucción de la estructura del cartílago en ambos WT y PGRN-/ - ratones (flechas rojas). Tanto la pérdida de proteoglicanos y la degradación del cartílago sugieren la inducción exitosa de la fenotipo OA. Las barras de las columnas indicandoed la variación entre los miembros del grupo intra siguiente operación DMM. Sin embargo, el bar es relativamente corto, y knockouts PGRN aparece una mayor pérdida de proteoglicanos y la estructura del cartílago fue más severamente destruida en comparación con el tipo de raza salvaje. Por otra parte, se realizó el análisis estadístico para la puntuación de cartílago que se describió anteriormente 25, y la puntuación de cartílago fue significativamente mayor en los knockouts PGRN que el grupo PESO. Nuestros resultados demuestran que una pérdida de PGRN resultó en más grave fenotipo de OA.

Figura 1
Figura 1. Procedimiento quirúrgico para la inducción DMM. a. Una incisión para-patelar medial se hace en la piel de articulación de la rodilla. b. Exposición de la rodilla del espacio articular después de la luxación lateral de la cápsula articular. c. Inner structura de la articulación de la rodilla. La flecha azul indica menisco medial. Flecha amarilla muestra ligamento meniscotibial. D. Menisco medial se desestabiliza. Flecha azul indica que el menisco medial que se dislocó de sitio original. Flecha amarilla muestra parte residual del ligamento meniscotibial que se ha diseccionado. D. La cápsula articular está cerrado. F. Se cierra la piel. Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2
Figura 2. Representante imágenes de histología y análisis estadístico para la puntuación de la osteoartritis A. representativas imágenes histológicas de WT y PGRN-/ -. Ratones 8 semanas tras la operación simulada o DMM, Se ensayó mediante tinción con safranina O. Las flechas rojas indican la destrucción del cartílago. Pérdida del color rojo en el cartílago implica la pérdida de proteoglicanos. La barra de escala, 100 micras B. El análisis estadístico para la puntuación de la osteoartritis en ambas PGRN-/ -.. Ratones y WT clic aquí para ver la imagen más grande.

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Discussion

Se ha informado de que la cepa de ratones es muy importante para el modelo de DMM de inducción, como diferentes cepas de ratones han diversa gravedad de la OA después de DMM, con más alto nivel en la cepa 129/SvEv, seguido de C57BL6, 129/SvInJ y luego FVB / n 26. Una gran parte de los transgenes se establecen en ratones C57BL6, como PGRN-/ - ratones que usamos en el presente estudio, que son relativamente susceptibles a DMM. Sin embargo, si el transgén se basa en la cepa insensible tales como FVB / N ratones, es necesario retrocruzamiento estos ratones con cepas sensibles antes de DMM de inducción. El sexo de los ratones utilizados para DMM inducción es también muy importante ya que los estudios han demostrado que los ratones hembras son menos sensibles que los ratones machos 27. Por otra parte, la edad de los ratones para la operación DMM varía de 8 semanas de edad a 12 semanas de edad sobre la base de la literatura 29, que también juega un papel crítico en la patogénesis de la OA. Por lo tanto, los ratones de la misma edad deben ser operados para eliminar este efecto. Se requiere el control del dolor post operatorio para mejorar el movimiento de los ratones después de la cirugía. Como modelo DMM lleva a OA a través del movimiento mediada por desgaste en el cartílago, el movimiento inadecuada como resultado de dolor postoperatorio puede causar inconsistencia de desarrollo de OA. Actualmente existe una discrepancia sobre la definición de DMM sobre si procede o no remover el menisco medial 4,28. En nuestro estudio, nos limitamos desestabilizado menisco medial pero no quitarla. Las lesiones en el modelo de DMM se encuentran principalmente en la región central de soporte de peso de la meseta tibial medial, y la gravedad de las lesiones aumentaron durante el curso del tiempo (datos no publicados), y los resultados fueron consistentes con los informes anteriores 5. Por otra parte, la puntuación OARSI siguiente operación DMM fue relativamente consistente entre los diferentes miembros del mismo grupo genético.

PGRN juega un papel importante en el desarrollo del cartílago y la artritis 14,21. Nosinformado anteriormente que interactúa con PGRN metaloproteasas ADAMTS-7 y ADAMTS-12, y protege el cartílago proteína de la matriz COMP de la degradación 19. Por otra parte, está bien establecido que el TNF-α juega un papel crítico en la destrucción del cartílago 24. Recientemente, hemos encontrado que PGRN antagoniza el TNF-α y protegido contra la destrucción del cartílago en modelos de artritis inflamatorias 14. En este estudio, se indujo modelo DMM en WT y PGRN-/ - ratones, y como se esperaba, PGRN-/ - ratones mostraron progresión exagerada de OA después de la inducción de DMM, que se indica con la pérdida más severa de proteoglicanos en la tinción de safranina O y significativamente más alta puntuación de la artritis basada en la histología (Figura 2). Por otra parte, las expresiones de marcadores catabólicos fueron elevados de manera espectacular en PGRN-/ - grupo (datos no publicados), lo que sugiere la progresión de la OA acelerado en la deficiencia de PGRN.

En conclusión, nuestro protocolo de establecimiento de DMM modelo sfenotipo OA uccessfully inducida en WT y PGRN-/ - ratones, y la inducción fue consistente y reproductiva. La generación exitosa del modelo DMM en ratones C57/B6 proporciona una herramienta útil para evaluar agentes terapéuticos y genes relacionados con la OA para la OA en el futuro. En el estudio actual, el resultado del modelo DMM documenta una función protectora de PGRN en el desarrollo de la OA.

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Disclosures

Estamos aquí declaramos que no tenemos ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por el NIH subvenciones de investigación R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, y una enfermedad objeto de Becas de Investigación de la Fundación de Investigación de Reumatología (a CJ Liu).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
No. 10 Surgical blades Feather 25-2976#10
6-0 suture Applied Dental WG-N53133

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