Summary
Vi beskriver en protokol for en destabilisering af den mediale menisk (DMM) model i mus, et effektivt redskab for slidgigt (OA) forskning. Desuden har vi påvist, at mangel på progranulincan overdrive OA udvikling og progression ved hjælp af denne model, hvilket indikerer, at progranulin spiller en beskyttende rolle i patogenesen for OA.
Abstract
Destabilisering af mediale menisk (DMM) model er et vigtigt redskab til at studere de patofysiologiske roller talrige arthritis associerede molekyler i patogenesen af slidgigt (OA) in vivo. Men den detaljerede, især visualiseret protokol for at etablere denne kompliceret model i mus, er ikke tilgængelig. Heri tog vi fordel af vildtype og progranulin (PGRN) - / - mus som eksempler for at indføre en protokol for at fremkalde DMM model i mus, og sammenlignede den begyndende OA efter oprettelsen af denne kirurgisk induceret model. De operationer, der udføres på mus var enten fingeret operation, som netop åbnet ledkapsel eller DMM drift, hvilket skære menisco-tibiale ligament og forårsagede destabilisering af mediale menisk. Slidgigt sværhedsgrad blev vurderet ved hjælp af histologiske analyse (f.eks Safranin O farvning), udtryk for OA-associerede gener, nedbrydning af brusk ekstracellulære matrix molekyler og osteophyte formularation. DMM drift held induceret OA initiering og progression i både vildtype-og PGRN-/ - mus og tab af PGNR vækstfaktor ført til en mere alvorlig OA fænotype i dette kirurgisk induceret model.
Introduction
Slidgigt (OA), også kendt som slidgigt, berører 15% af verdens befolkning og mere end 46 mio mennesker i USA, og er kendetegnet ved synovitis, brusk degeneration og osteophyte dannelse 1.. Det kan være et resultat af et komplekst samspil af genetiske, metaboliske, biomekaniske og biokemiske faktorer. De underliggende mekanismer i OA fortsat at unddrage sig det videnskabelige samfund. Der er i øjeblikket mange dyremodeller, som kan efterligne patogenesen af OA 2,3. Det er vigtigt at skabe dyremodeller i mus på grund af både tilgængeligheden af forskellige genetisk modificerede mus og omkostningseffektivitet eksperimenter. Blandt de forskellige typer af eksperimentelle OA modeller er kirurgisk induceret destabilisering af mediale menisk (DMM) model er et accepteret OA model på grund af dens gode reproducerbarhed og en relativt langsommere progression under OA udvikling. Begge disse egenskaber harværet nøglen til evaluering af OA progression i forskellige behandlinger eller transgener 3-8. Imidlertid er konsistensen af kirurgisk OA model påvirkes af forskellige faktorer under operationen og som et resultat, er anvendelsen af kirurgiske musemodel begrænset.
Progranulin (PGRN) er en multi-funktionel vækstfaktor udtrykt i forskellige celler. Det vides, at PGRN spiller en kritisk rolle i forskellige fysiologiske processer og sygdomsprocesser, såsom sårheling 9 tumorigenese 10 og inflammation 11-15. Undersøgelser også vist, at utilstrækkelig PGRN kan forårsage degenerative sygdomme i nervesystemet hos både mennesker og mus 16-18. Det vides, at PGRN udtrykkes i human ledbrusk, og niveauet er signifikant forhøjet i brusk hos patienter med OA og rheumatoid arthritis 19. Derudover PGRN spiller også en afgørende rolle i chondrocyt proliferation 20, differentiering og endochondralforbening af vækst plade under udviklingen 21,22. Vi har for nylig rapporteret, at PGRN antagoniserede TNF-α ved binding til TNF-receptorer og udviser en anti-inflammatorisk funktion i inflammatoriske arthritis modeller 13,14,23,24. , Rolle PGRN i OA, især in vivo, er imidlertid stadig at være en gåde. Heri præsenterer vi proceduren for at fremkalde en kirurgisk DMM model, og undersøge den rolle PGRN i OA udvikling gennem oprettelse af DMM model i WT og PGRN-/ - mus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle de kirurgiske procedurer for dyrene skal godkendes af den lokale Institutionens Animal Care og etiske komité, med en indsats for at minimere smerte og ubehag forårsaget af operationen.
1.. Forberedelse
- Vælg 8-12 uger gamle mandlige C57BL / 6 mus med en kropsvægt på omkring 25 g for kirurgi.
- Bedøve dyrene ved intraperitoneal injektion af en cocktail, der indeholder både xylazin (5 mg / kg) og ketamin (40 mg / kg).
- Barbere knæet med barbermaskiner, så kirurgisk drapere dyret og sterilisere kirurgiske site med betadin og alkohol (3x) og dækker musen øjnene med salve.
2. Kirurgisk Process
- Lav en 1 cm langsgående medial para-patellar snit til at eksponere knæleddet.
- Åbn knæleddet forsigtigt gennem lateral forskydning af patella og patella ligament.
- Skær knæleddet kapsel på langsgennem den mediale para-patellar indsnit i trin 2.1.
- Dissekere knæleddet kapsel med en pincet.
- Grib den distale del af bagpote med venstre hånd, og udfører lateral forskydning af patella og patella ligament med pincet. Hold bagpoten blidt og sørg for at undgå traumer i poten. Jo bedre ledkapslen dissekeres, jo mindre kraft kræves for at gøre uro.
- Dryp sterilt saltvand på overfladen af ledbrusk under drift for at undgå udtørring af bruskoverfladen.
- Skær igennem den mediale meniscotibial ligament som forankrer mediale menisk til den tibiale plateau. Undgå skade brusken under den mediale menisk.
- Identificer den mediale menisk som lokaliserer mellem mediale condyle af lårben og mediale plateau af skinnebenet.
- Identificer den meniscotibial ledbånd, der forbinder laterale side af mediale menisk med interkondylære eminence af skinnebenet.
- Hold hind pote forsigtigt med hånden, og skære gennem den mediale meniscotibial ligament omhyggeligt ved hjælp af en nr. 10 kirurgisk kniv. Sørg for ikke at forårsage skade på ledbrusk og andre ledbånd. I mange tilfælde skal trækkes til side, men ikke at blive fjernet for at identificere ligamentet tildækningen fedtpude.
- Luk knæleddet kapsel med en 6-0 resorberbar sutur.
- Luk huden med 6-0 silke sutur.
3. Postoperativ pleje
- Påfør en dråbe 0,25% bupivacain i operationsstedet på hver mus for at minimere postoperative smerter.
- Lad de opererede mus gratis at få vand og mad.
4.. Histologisk Scoring Kirurgisk DMM Model
- Sacrifice musene ved angivne tidspunkter (fx 4 uger, 8 uger og 12 uger. Her viste vi resultaterne på 8 uger som repræsentant) efter operationen.
- Hele knæled er faste, afkalket, embedded af paraffin og derefter sektioneret serielt på 5 um interval.
- Skær hele bagbenene med nr. 10 vinger.
- Dissekere hud og muskler af bagbenene omhyggeligt, og fastgør prøverne med 4% PFA i 3 dage i RT.
- Fjern PFA, og rengør prøverne med vand. Bagefter afkalkningen prøverne i EDTA ved 4 ° C i 2 uger.
- Dehydrer prøverne i et ethanol gradient. I detaljer, holde prøverne i 70% ethanol i 1 time, derefter ændre ethanol og holde prøverne i et nyt sæt af 70% ethanol for O / N. Bagefter satte prøverne i 80% og 90% ethanol dermed, og holde dem i 1 time,, efterfulgt af 100% ethanol for O / N.
- Fjern ethanol. Opbevar prøverne i oxylene i 1 time, og skifte til et nyt sæt oxylene. Gentag dette trin 3x.
- Integrer prøverne i en paraffin skimmel ved hjælp af Leica indlejring center. Bagefter prøverne snit på 5 um under anvendelse af en roterende mikrotom (Leica RM2255, Tyskland) og derefter opsamlet på objektglas.
- Serielle sagittale sektioner skæres for hver prøve spænder over en region fra midten af den laterale kondyl til midten af den mediale kondyl.
- Safranin O farvning er udført, efterfulgt af scoring og statistiske analyser gennem OARSI pointsystem som beskrevet tidligere 25.
- Først afparaffiniser dias i oxylene, og fugter dem i en ethanol gradient til destilleret vand. Derefter dias farves gennem Weigert Iron hematoxylinopløsning, 0,05% Fast Green (FCF) Løsning, 1% eddikesyre, og 0,1% Safranin O Solution. Monter dias ved hjælp af harpiksholdige medium.
- Scorer Safranin O farvede objektglas på grund af tab af proteoglycan (rød farve) i brusk og procentdelen af ødelæggelse i brusk struktur, gøre statistisk analyse for den histologiske score.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DMM model blev succes etableret i mus, og mangel på PGRN overdrevet kirurgisk induceret OA udvikling.
Sham og DMM operationer (figur 1) blev udført i WT og PGRN-/ - mus. 8 uger efter operationen blev musene aflivet, og Safranin O-farvning blev udført på snit fra knæleddene, efterfulgt af statistisk analyse af arthritis score baseret på histologi. Som vist i figur 2A, der var ingen indlysende degeneration af brusk i begge genotyper i skinoperation grupper baseret på Safranin O-farvning, hvilket indebar lignende grundlinjebetingelserne (øverste paneler). 8 uger efter DMM operation (lavere paneler), der var tab af proteoglycan og ødelæggelse af brusk struktur i både WT og PGRN-/ - mus (røde pile). Både tabet af proteoglycan og nedbrydning af brusk antyder en vellykket induktion af OA fænotype. Søjlerne i kolonnerne indicated variationen mellem intra gruppemedlemmer efter DMM operation. Men bar er relativt korte, og PGRN knockouts vises et højere tab af proteoglycan og bruskstruktur var mere alvorligt ødelagt i sammenligning med vildtype-racen. Desuden blev den statistiske analyse for brusk score udført som beskrevet tidligere 25, og brusk score var signifikant højere i PGRN knockouts end WT-gruppen. Vores resultater viste, at et tab af PGRN resulteret i mere alvorlige OA fænotype.
Figur 1. Kirurgisk procedure for DMM induktion. en. En medial para-patellar indsnit er lavet i huden af knæleddet. b.. Eksponering af knæleddet mellemrum efter lateral forskydning af ledkapslen. c.. Inner sSTRUKTUR af knæleddet. Blå pil angiver mediale menisk. Gul pil viser meniscotibial ledbånd. D.. Medial menisken er destabiliseret. Blå pil angiver den mediale menisk, der er forvredet fra oprindelige websted. Gul pil viser resterende del af meniscotibial ligament, som er blevet dissekeret. D.. Ledkapslen er lukket. F.. Huden er lukket. Klik her for at se større billede.
Figur 2. Repræsentative billeder af histologi og statistiske analyser for score af slidgigt A. Repræsentative histologiske billeder af WT og PGRN-/ -. Mus otte uger efter fingeret operation eller DMM, Analyseret ved Safranin O-farvning. Røde pile indikerer ødelæggelse brusk. Tab af rød farve i brusk indebærer tab af proteoglycan. Scale bar, 100 um B. Statistisk analyse for score af slidgigt i begge PGRN-/ -.. Og WT mus Klik her for at se større billede.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det forlyder, at den stamme af mus er meget vigtigt for DMM model induktion, har så forskellige stammer af mus varierende sværhedsgrad af OA efter DMM, med højeste niveau i 129/SvEv stamme, efterfulgt af C57BL6, 129/SvInJ og derefter FVB / n 26. En stor del af transgener er etableret i C57BL6-mus, såsom PGRN-/ - mus vi anvendt i den foreliggende undersøgelse, som er forholdsvis modtagelig for DMM. Hvis transgenet er baseret på ufølsom stamme såsom FVB / n mus, er det nødvendigt at backcross disse mus med følsomme stammer før DMM induktion. Kønnet af mus anvendt til DMM induktion er også meget vigtigt, da undersøgelser allerede har vist, at hunmus er mindre følsomme end hanmus 27. Desuden alder af mus for DMM operation varierer fra 8 uger gammel 12 uger gammel baseret på litteratur 29, som også spiller en afgørende rolle i patogenesen af OA. Derfor bør mus på samme alder skal betjenes for at fjerne denne virkning. Postoperative smerter kontrol er nødvendig for at forbedre den frie bevægelighed for mus efter operationen. Som DMM model fører til OA gennem bevægelse medieret slid i brusk, utilstrækkelig bevægelse som følge af postoperative smerter kan forårsage inkonsistens OA udvikling. I øjeblikket er der en uoverensstemmelse vedrørende definitionen af DMM om, hvorvidt eller ikke at fjerne den mediale menisk 4,28. I vores nuværende studie, vi blot destabiliseret mediale menisk, men ikke fjerne det. Læsioner i DMM-model blev primært placeret på den centrale vægtbærende region mediale tibia plateau, og sværhedsgraden af læsioner steg i tidsforløbet (upublicerede data), og resultaterne var i overensstemmelse med de tidligere rapporter 5. Desuden OARSI score efter DMM operation var relativt konsistente mellem forskellige medlemmer af den samme genetiske gruppe.
PGRN spiller en vigtig rolle i udvikling af brusk og gigt 14,21. Vitidligere rapporteret, at PGRN samspil med metalloproteaser ADAMTS-7 og ADAMTS-12, og beskytter brusk matrixprotein COMP fra nedbrydning 19. Desuden er det veletableret, at TNF-α spiller en kritisk rolle i brusk ødelæggelse 24. For nylig fandt vi, at PGRN antagoniserede TNF-α og beskyttet mod ødelæggelse brusk i inflammatoriske arthritis modeller 14. I denne undersøgelse inducerede vi DMM model i WT og PGRN-/ - mus, og som forventet, PGRN-/ - mus udviste overdrevet progression af OA efter induktion DMM, som blev indikeret ved mere alvorligt tab af proteoglycan i Safranin O-farvning og betydeligt højere arthritis score baseret på histologi (figur 2). Desuden blev udtrykkene for kataboliske markører dramatisk forhøjet i PGRN-/ - gruppen (upublicerede data), hvilket tyder på accelereret OA progression i mangel af PGRN.
Afslutningsvis vores protokol for etablering af DMM model successfully induceret OA fænotype i WT og PGRN-/ - mus og induktion var konsekvent og reproduktiv. Den vellykkede generation af DMM model i C57/B6 mus giver et nyttigt redskab til at vurdere terapeutiske agenter og OA gener for OA i fremtiden. I den aktuelle undersøgelse, resultatet af DMM model dokumenterer en beskyttende rolle i PGRN i OA udvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi heri erklærer, at vi ikke har nogen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev delvist støttet af NIH forskningstilskud R01AR062207, R01AR061484, R56AI100901, K01AR053210, og en sygdom Targeted Research Grant fra Rheumatology Research Foundation (til CJ Liu).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| No. 10 Surgical blades | Feather | 25-2976#10 | |
| 6-0 suture | Applied Dental | WG-N53133 |
References
- Herndon, J. H., Davidson, S. M., Apazidis, A. Recent socioeconomic trends in orthopaedic practice. J. Bone Joint Surg. Am. 83, 1097-1105 (2001).
- Johnson, K., et al. A stem cell-based approach to cartilage repair. Science. 336, 717-721 (2012).
- Yang, S., et al. Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction. Nat. Med. 16, 687-693 (2010).
- Glasson, S. S., et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature. 434, 644-648 (2005).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of osteoarthritis in the 129/SvEv mouse. Osteoarthr. Cart. 15, 1061-1069 (2007).
- Chia, S. L., et al. Fibroblast growth factor 2 is an intrinsic chondroprotective agent that suppresses ADAMTS-5 and delays cartilage degradation in murine osteoarthritis. Arthritis Rheum. 60, 2019-2027 (2009).
- Miller, R. E., et al. CCR2 chemokine receptor signaling mediates pain in experimental osteoarthritis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20602-20607 (2012).
- Wang, Q., et al. Identification of a central role for complement in osteoarthritis. Nat. Med. 17, 1674-1679 (2011).
- He, Z., Ong, C. H., Halper, J., Bateman, A. Progranulin is a mediator of the wound response. Nat. Med. 9, 225-229 (2003).
- Bateman, A., Bennett, H. P. The granulin gene family: from cancer to dementia. Bioessays. 31, 1245-1254 (2009).
- Kessenbrock, K., et al. Proteinase 3 and neutrophil elastase enhance inflammation in mice by inactivating antiinflammatoryprogranulin. J. Clin. Invest. 118, 2438-2447 (2008).
- Yin, F., et al. Exaggerated inflammation, impaired host defense, and neuropathology in progranulin-deficient mice. J. Exp. Med. 207, 117-128 (2010).
- Liu, C. J. Progranulin: A promising therapeutic target for rheumatoid arthritis. FEBS Lett. , (2011).
- Tang, W., et al. The growth factor progranulin binds to TNF receptors and is therapeutic against inflammatory arthritis in mice. Science. 332, 478-484 (2011).
- Zhu, J., et al. Conversion of proepithelin to epithelins: roles of SLPI and elastase in host defense and wound repair. Cell. 111, 867-878 (2002).
- Baker, M., et al. Mutations in progranulin cause tau-negative frontotemporal dementia linked to chromosome 17. Nature. 442, 916-919 (2006).
- Cruts, M., et al. Null mutations in progranulin cause ubiquitin-positive frontotemporal dementia linked to chromosome 17q21. Nature. 442, 920-924 (2006).
- Wils, H., et al. Cellular ageing, increased mortality and FTLD-TDP-associated neuropathology in progranulin knockout mice. J. Pathol. , (2012).
- Guo, F., et al. Granulin-epithelin precursor binds directly to ADAMTS-7 and ADAMTS-12 and inhibits their degradation of cartilage oligomeric matrix protein. Arthritis Rheum. 62, 2023-2036 (2010).
- Xu, K., et al. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation. J. Biol. Chem. 282, 11347-11355 (2007).
- Bai, X. H., et al. ADAMTS-7, a direct target of PTHrP, adversely regulates endochondral bone growth by associating with and inactivating GEP growth factor. Mol. Cell. Biol. 29, 4201-4219 (2009).
- Feng, J. Q., et al. Granulinepithelin precursor: a bone morphogenic protein 2-inducible growth factor that activates Erk1/2 signaling and JunB transcription factor in chondrogenesis. FASEB J. 24, 1879-1892 (2010).
- Liu, C. J., Bosch, X. Progranulin: A growth factor, a novel TNFR ligand and a drug target. Pharmacol. Therap. 133, 124-132 (2012).
- Wu, H., Siegel, R. M.
- Glasson, S. S., Chambers, M. G., Den Berg, W. B. V. an, Little, C. B. The OARSI histopathology initiative - recommendations for histological assessments of osteoarthritis in the mouse. Osteoarthr. Cart. 18, 17-23 (2010).
- Glasson, S. S. In vivo osteoarthritis target validation utilizing genetically-modified mice. Curr. Drug Targets. 8, 367-376 (2007).
- Ma, H. L. Osteoarthritis severity is sex dependent in a surgical mouse model. Osteoarthr. Cart. 15, 695-700 (2007).
- Lin, A. C., et al. Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis. Nat. Med. 15, 1421-1425 (2009).
- Malfait, A. M., et al. ADAMTS-5 deficient mice do not develop mechanical allodynia associated with osteoarthritis following medial meniscal destabilization. Osteoarthr. Cart. 18, 572-580 (2010).
