Summary
我々は、マウスモデルにおいて、長期持続性の慢性緑膿菌気道感染を確立する寒天ビーズ法を記載している。
Abstract
モデル自体に関する懸念の数があるが、慢性気道感染症のマウスモデルは、嚢胞性線維症（CF）の研究における重要な資産である。少数の報告は、インビボで長期の慢性感染症に焦点を当ててきたが、炎症および感染の初期相は広く、 緑膿菌寒天ビーズマウスモデルを用いて研究されている。長期的な慢性感染症のための主な課題は、P.により低細菌量のまま細菌細胞が徐々にホストによってクリアされていることを示すチャレンジ後の緑膿菌感染したマウスの週の割合が低い。
本論文では、マウスでは、効率的な長期慢性感染を得るための方法を提示します。この方法は、Pの埋め込 みに基づいていますC57Bl/6NCrlマウスの気管内注入に続いて、in vitroで寒天ビーズ中緑膿菌臨床株、。両肺感染はSEVと関連している体重減少、死亡率、慢性感染症、および炎症性応答を含むERAL測定可能なリードアウト。 P.それは、比較的低い死亡率、より深刻な病変、および高い慢性感染をもたらしたため、 緑膿菌 RP73臨床株はPAO1の参照実験室株よりも好まれた。P.緑膿菌のコロニー形成は、3ヶ月以上の肺に固執することができる。マウス肺の病理は、高度な慢性肺疾患を持つCF患者のそれに似ている。
このマウスモデルに最も近いヒトの疾患の過程を模倣および病原性の研究および新規な治療法の評価のための両方に使用することができる。
Introduction
嚢胞性線維症（CF）は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）遺伝子の突然変異によって引き起こされる遺伝病である。この遺伝子は、ほとんどの上皮細胞の膜上に発現するクロライドチャネルをコードする。気管支拡張症、粘液詰まりおよび実質破壊は徐々にCF患者1のほとんどの深刻な肺疾患と死亡につながる緑膿菌感染が主な原因。 CFの病因と新しい治療法のさらなる発展を理解することは、CFの特徴を持つ動物モデルに依存しています。遺伝子操作のためのCFTR遺伝子改変いくつかのマウスは、生成されたが、CF-のような肺疾患およびCF患者に見られるいくつかの他の臓器の異常を再現するためにこれらの種の能力には限界が広く2実証されている。
感染症の発症は、CF動物モデルにおける主要な課題の一つである。文献CL初期のマウスは、寒天、アガロース、アルギン酸または海藻までの時間として固定化剤中に埋め込 まれた細菌を接種している場合にのみ、一ヶ月以上持続する慢性感染を達成することができることを示唆している。これらの固定化剤は、細菌が、同様にCF患者6の粘液の成長のために、微小コロニーの形で成長させる微好気/嫌気条件を提供しています。慢性感染症のこのモデルは、気道炎症および損傷7を引き起こす肺における細菌の持続性をもたらす。しかしながら、使用される方法細菌株および肺に接種用量に応じて、異なる時点で、肺で回収慢性感染マウスのパーセンテージおよび細菌負荷はかなり異なることができる。具体的には、長期的な慢性感染症のための主な課題は、P.により低細菌量のままチャレンジ後の緑膿菌感染したマウスの週の低い割合、THAを示すT菌体を徐々にホストによってクリアされます。 P.を選択することによりCFのコレクションから、 緑膿菌の RP73臨床株は8我々は成功し、低死亡率を得、より重度の病変を分離し、C57Bl/6NCrlマウスにおける1ヶ月まで安定細菌負荷による慢性感染の割合が高い。
本論文では、Pを埋め込 むための方法論を詳述寒天ビーズ中緑膿菌 、我々は、気管内注入によりマウスを感染させた肺中の細菌負荷およびサイトカインを測定し、BAL液を採取し、組織学的検査を行った。全体的に、このプロトコルは、病因の8,9に根本的に重要な問題に対処するとP.に対する新規治療法をテストする際に研究者を支援します緑膿菌慢性感染10,11。
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Protocol
1。慢性感染の準備菌（前マウスの挑戦への3つの二日）
- 適切なPを切り替える緑膿菌の菌株は試験される。
- Pの白金耳を接種トリプチケースソイ寒天（TSA）プレートに-80℃で保存培養から緑膿菌とは、37℃で一晩インキュベートする。
- シングルコロニーを採取し、15ミリリットルスナップキャップ付きチューブに5ミリリットルトリプチケースソイブロス（TSB）に接種し、200 rpmで振とう培養器で37℃で一晩インキュベートする。
2。慢性感染症のために寒天ビーズ中の細菌を埋め込む（感染前に一日）
- 、細菌の一晩培養物の少量のアリコートを取り、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で1:50に希釈し、600nmでの光学密度（OD）を測定する。
- 新鮮なTSBの20ミリリットルを含む新しいスナップインキャップのチューブに2 ODを追加することで、一晩細菌培養を希釈します。
- 約3 37℃で培養する -10月15日ODの合計に達するまで、200 rpmで振とう培養器で期まで4時間。
- 一方、TSAを調製、1.5％寒天、オートクレーブTSB製の水浴中で50℃で平衡化。水浴中で50℃で三角フラスコにpreautoclaved重質鉱油150mlの平衡化。
- P.回緑膿菌は対数期に到達し、4℃で15分間、2,700×gでの遠心分離により菌体を回収し、上清を捨てる。
- 完全にペレットを再懸濁するために徹底的に細菌の滅菌PBS 1ミリリットル中のペレットと渦を懸濁します。
- 液体TSAの9ミリリットル、50℃で予め平衡と混合1ミリリットル細菌懸濁液
- 10ミリリットルTSA-Pを追加緑膿菌 （50℃で温めておいた）重質鉱油と混合し、直ちに、室温で6分間撹拌する。攪拌は、油で目に見える渦を生成しなければならない。
- 最小種で撹拌し、4℃に混合物を冷却35分（ 図1）のためのEED。
- さらに20分間氷中の寒天ビーズ - オイル混合物を置き。
- 4℃で15分間2700×gで50ミリリットルファルコンチューブと遠心分離機に寒天ビーズを転送
- 正確に鉱油を除去し、ステップ2.11に記載のように、滅菌PBSで6回洗浄する。 3回洗浄後、ビーズを代わりに遠心分離機を使用する重力によってペレット化することができる。最後の洗浄の後に20〜30 mlのPBSで寒天ビーズを懸濁します。
- ビーズ（約0.5ミリリットル）の一定量を取り、無菌的に均質化する。
- 均質化されたビーズを100μlを取り、滅菌PBS900μlの中に希釈する。シリアルに10 -6まで1:10希釈する。
- 10 -6まで希釈されていないサンプルを含むTSAプレート上にプレート段階希釈し、37℃でプレートをインキュベート
- いくつかの分野での倒立光学顕微鏡を用いてビーズ径を測定します。ビーズ直径は、（100〜200ミクロンの間である必要があります
- 4℃で一晩ビーズを保存
図1。寒天ビーズの準備と、マウスの感染の概要。P. 緑膿菌細胞を1mlのPBSに再懸濁し、液体TSA（50°C）を9mlに添加する。この混合物をフラスコ中で50℃での重質鉱油150mlに加え、室温で6分間、高速で撹拌する。フラスコを35分間ゆっくり撹拌しながら4℃に冷却されると、寒天が固化ビーズを作成し、この混合物中に存在する細菌を寒天ビーズ内に埋め込まれている。細菌細胞を含有する寒天ビーズの詳細については（A）に示されている。滅菌PBSを用いて数回洗浄して鉱物油を除去した後、寒天ビーズ懸濁液をf準備ができているまたは気管内注入（B）によるマウスの肺における接種。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
3。寒天ビーズを用いたマウスの挑戦
倫理声明：このプロトコルおよび実験はサンラファエル科学研究所の動物のケアと倫理委員会からのガイドラインに従ってください。
- 寒天ビーズ懸濁液中にCFU / mlの数を決定するために、TSAプレート上でコロニー形成単位数（CFU）を数える。 50μlの1〜2×10 6の最適な接種物に到達するために2-4×10 7 CFU / mlに滅菌PBSで寒天ビーズを希釈する。
- 0.002ミリリットル/ g体重の容量で投与し、0.9％NaCl中C57Bl/6NCr（20〜22 gで6〜8週齢）雄性マウスにケタミン（50 mg / mlで）およびキシラジン（5 mg / mlで）を麻酔腹腔内注射。
注：麻酔がADEQ考えられている動物が静かに静止しuateは、外部刺激に反応しない、かつ一定の心臓や呼吸数を持っています。 - 仰臥位でマウスを置きます。 70％エタノールでマウスのコートを消毒する。
- 皮膚の縦カットで気管を露出し、無菌の、柔軟性のある22のG 0.9ミリメートル×25ミリメートルIVカテーテルで気管挿管、気管内に下降しながら、スタイレットを除去するために注意を保つ。あまりにも深く気管にカテーテルを挿入します。カリーナ（分岐部）に到達する前に停止します。
- すぐに1ミリリットルの注射器で寒天ビーズ懸濁液の50μlの容量を取得し、カテーテルに取り付けます。ビーズは穏やかに肺内に注入されることを可能にする、シリンジのプランジャを押す。縫合糸クリップを使用して切開を閉じます。
- 完全に目覚めまで加熱パッド上に動物を配置します。
4。マウス評価
- コートの質、姿勢を含む臨床徴候について毎日マウスを観察し、歩行、および水和状態。毎日の体重を監視します。 ≥20％の体重を失うのマウスは安楽死させなければなりません。
- BAL、サイトカイン分析の合計と差分細胞数の面で気管支肺胞洗浄液（BAL）及び肺の収集と、総CFUの分析、組織学的分析、炎症反応のためのポイント6または7を収集するためのポイント5に従い、ミエロ（MPO）活性。
5。 BAL液の収集と分析
- CO 2吸入によりマウスを安楽死させる。
- 仰臥位でマウスを置きます。 70％エタノールでマウスのコートを消毒する。
- 皮膚の縦カットで気管および胸郭を公開します。振動板を切断することによって肺を公開します。
- ピンセットを用いて気管の下に縫合糸を挿入し、滅菌した、柔軟性のある22グラム0.9ミリメートル×25ミリメートルIVカテーテルで気管挿管。約を結合するために縫合糸の両端を引っ張る気管にtheterや気管の周りの糸を結び目。
- 1ミリリットルの注射器を使用したRPMI 1640の1ミリリットルの容量を取得し、カテーテルに取り付けます。肺を洗浄し、すぐに15ミリリットルチューブに格納し、液体を回収するために、注射器のプランジャーを押してください。
NOTE：サイトカインが分析される場合には、RPMI 1640にプロテアーゼ阻害剤を加える。 - のRPMI 3ミリリットルの合計で、この手順を3回繰り返します。今後は、氷上でBAL液を保存する。肺の収集と分析のための手順6に進みます。
注：（2.8ミリリットル最大）すべての液体が取得されますのでご注意ください。 - BAL液中に存在する細菌の定量のために、少量のアリコート（300μl）をサンプリングし、直列TSAプレート上に、滅菌PBSでプレートを1:10に希釈し、37℃で一晩インキュベートする。
- ビルケル細胞計数チャンバ内Tuerk溶液でBAL液を1:2のアリコートを希釈光倒立光学顕微鏡を用いて総細胞数を数える。
- Rを遠心分離4℃で8分間、330×gでBAL流体をemaining -80℃で保管する、ELISAサイトカイン分析用上清を取りサイトスピンによる差動細胞計数のためのステップ5.10から5.13に従ってください。
- ペレットが赤色の場合、RBC溶解緩衝液の250〜300μlにペレットを再懸濁し、赤血球を3分間超純蒸留水で1:10に希釈溶解する。 4℃で8分間330×gで2ミリリットルのPBSと遠心で中和
- 上澄み液を捨て、RPMI中、10％ウシ胎児血清（FBS）でペレットを再懸濁します。総細胞数に基づいて、1×10 6細胞/ mlを、提供するボリュームを使用する。
- 段ボールフィルタはサイトスピンの中心を向くように、サイトスピンでの適切なスロットに顕微鏡スライドとフィルタを配置します。 5分間300×gで細胞遠心でのサイトスピンし、遠心機の適切なウェルに各サンプルの150μlのピペット。
- MAによると、ロマノフスキーは市販のキットを使用して染色することによって、スライドを染色するnufacturerの指示や、以前に説明したように12。手順MPO活性分析のための5.14から5.17に従ってください。
- 遠心機で4℃で5分間、380×gでBALの残量上清を捨て、細胞を溶解するために超純蒸留水にヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロ250μlの0.5％でペレットを再懸濁します。懸濁液は、アッセイを行う前に、数日間-20℃で凍結することができる。
- 遠心機4℃で30分間、16,000×gで試料の各ウェル場合に必要、また適切な希釈物を二重に試料を添加し、96ウェルプレート中でMPOアッセイを行うために上清を使用する。
- ウェル中の各試料に加える等量の3,3 '、5,5'ペルオキシダーゼの基質としてテトラメチルベンジジン（TMB）。反応は、少なくとも5分間、そして色のさらなる発展がなくなるまで、暗所で起こることを可能にする。
- 2 H 2 SO 4 Aを添加して反応を停止させるND 450 nmでのODを測定する。 OD値は、ペルオキシダーゼ活性に正比例する。
6。肺およびサイトカイン分析における細菌負荷の測定
- すぐにBAL液を採取後、マウスからの物品の肺には、、、滅菌PBSで別々のローブが、それらを洗い流し滅菌PBS 2mlで丸底チューブに入れ、氷上に保存します。
NOTE：サイトカインが分析される場合には、チューブにPBSにプロテアーゼ阻害剤を加える。 - 無菌的に肺を均質化、ホモジネートから少量（300μl）を取る、シリアルにTSAプレートに、PBS中にプレートを1:10に希釈し、37℃で一晩インキュベートする。総気道細菌負荷は、BAL液および肺で見つかったCFUの合計になりますのでご注意ください。
- 4℃で30分間16,000×gで、残りのホモジネートを遠心分離ELISAのサイトカイン分析のために上清を取り、-80℃で保存
7。組織学的検査
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Representative Results
プロトコルは、P.、正しく行われているときシュードモナス寒天ビーズは100〜200ミクロンの間を測定し、スライド上の寒天ビーズ懸濁液少量のピペッティングすることによって倒立光学顕微鏡で観察することができる。 図1に詳細に示すように、単一の細菌細胞は、寒天ビーズに見える。
Pの選択寒天ビーズ調製に使用される緑膿菌株は非常に重要です。 図2と表1 Pとマウスの感染後に得られたデータを示している緑膿菌 PAO1の参照実験室株RP73臨床分離株と比較した。死亡率は、感染の最初の3日以内に観察され、両方の株について低いが、PAO1（図2Aおよび2B）より高い。生存マウスにおける慢性感染症の割合の面でかなりの違いがPAO1とRP73チャレンジしたマウスの間で観察することができます。ウコンE 3日目、感染後、すべてのマウスはまだ両方のPで感染していた緑膿菌の株は、この時点の後、いくつかのマウスは、細菌をクリアし、他は安定した慢性感染症を発症した。以降7日から慢性的に感染したマウスの割合は株の両方のために28日まで安定していた。 PAO1かを示す、RP73用割合が75から87.1パーセント（ 図2B）であったが、20から27.8パーセント（ 図2A）の範囲であったマウスの割合で慢性感染につながることを、P.緑膿菌 PAO1株は、臨床実験室株と比較して、慢性感染を確立する際に、より効率的であった。 3日間、感染後の細菌の数は、7日から、その後、RP73（1.3×10 6 CFU /肺）（ 図2D）と比較した（ 図2Cおよび表1）（5×10 7 CFU /肺）PAO1のために高かった慢性感染が確立されたときに以降、細菌負荷は10〜で安定<両方の株についてSUP> 4と10 5 CFU /肺。慢性感染症が確立されると、CFU /肺の数は、一ヶ月にわたって著しく変化しない。また、気道内の細菌負荷は異なる細菌株9,13でチャレンジしたマウスの間で類似しています。
宿主の炎症応答および組織病 理を含む他のリードアウトは、挑戦とは異なる時点で測定することができる。 図3は、7日間、P.による攻撃からマウスBAL液中の白血球動員の面で炎症反応を示しています緑膿菌 RP73臨床株は、寒天ビーズに包埋した。 RP73-感染マウスを、感染していないマウスと比較した。ディファレンシャル細胞カウントは、好中球、マクロファージ、およびリンパ球が含まれていた。総細胞数は、非感染マウスと比較して、RP73感染マウスにおいてかなり高い。好中球は、特に、感染していないマウスのBAL液中のほぼ完全に不在で、ほとんどのreprた慢性感染に対する自然免疫系によるかなりの応答を示す、RP73感染マウスの細胞タイプをesented。
マウスからの肺の組織病 理学的分析は、慢性的に感染したP.緑膿菌 RP73は、感染が多能焦点であることを示している。4Cおよび4Fは （ 図4Bおよび4E）影響を受けていないか、わずかに関与する他のローブよりもより複雑で1葉を示している。ビーズは、気管支内腔に観察することができ、細菌細胞の微小コロニーは（ 図4Cおよび4F）ビーズに表示されます。感染に伴う地域の肺の組織病理は、気管支および肺実質に炎症性病変を示した。実質はマクロファージ、リンパ球およびいくつかの好中球が浸潤したのに対し、気管支は、ビーズを囲む大量の好中球の炎症により充填した。の組織学感染していないマウスを対照として使用した。実質および気管支の両方が、炎症性細胞（ 図4Aおよび図4D）から明らかであった。
図2。 Pの時間経過PAO1の参照株とRP73臨床株。C57BL/6NCrl（20〜22 g）の雄マウスはPの1 6〜5×10 cfuの気管内注入により感染されたとの緑膿菌慢性感染寒天ビーズに包埋緑膿菌 PAO1 株 （A及びC）又はRP73（BおよびD）。各時点では、ヒストグラム（パーセンテージ菌血症により誘導された死亡率（ 赤 ）と生存（ 灰色 ）または感染をクリア動物の割合を表す白）および慢性感染（ 緑 ）（A及びB）を確立することができるものである。生き残ったマウスは、示された時点で安楽死させ、肺を採取し、ホモジナイズし、細菌負荷を決定するTSAプレート上で培養した。マウス肺におけるPAO1およびRP73株の増殖曲線は、（C及びD）が示されている。ドットは、個々の測定値を表し、水平線は中央値を表す。フィッシャーの検定による統計的有意性が示されます。* P <0.05、** P <0.01、** P <0.001。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
表1。 Pの時間経過緑膿菌PAO1の参照株とRP73臨床株による慢性感染症。 死亡率およびPAO1とRP73感染マウスおよび肺（中央値）あたりのCFUの数の慢性感染の割合が示されている。値は2-4の異なる実験から選択される。nは、ノー。プールされたマウスの各条件について分析した。フィッシャーの検定による統計的有意性が示されます。* P <0.05、** P <0.01、** P <0.001。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図3。 RP73臨床株による慢性感染の7日後のBAL液中の炎症の評価。（A）のグラフは、全体の内容を示しています白血球、好中球および単球/マクロファージは、感染していないマウス（対照）と比較した攻撃から7日後にRP73慢性的に感染したマウスのBAL液中に回収。平均値及びSEMが表現されます。サイトスピンした後、スライド上にスポットで見られるように矢印の下にあるボックスで（B）は、好中球やマクロファージを示している。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
図4。 RP73臨床株による慢性感染の7日後にヘマトキシリンおよび肺の組織切片上エオシン染色。パネルは非感染マウス（AとD）の肺切片のとchallengマウスのヘマトキシリンおよびエオシン染色を示すRP73（B、C、E、F）を含有する寒天ビーズを編他の人が影響を受けないか（B及びE）わずかに関与しているのに対し、感染は、多能焦点であり、一般的に、1つ以上の肺葉（CおよびF）を含む。矢印は、気管支内腔（B）に寄託寒天ビーズを示している。行（A、B、C）が250μm、。ライン（D、E、F）は100μmで拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
P.における重要なステップ緑膿菌ビーズの準備とマウスの課題を以下に報告されています。
マウスの挑戦のために使用される緑膿菌株は非常に重要です。死亡率、慢性感染症やクリアランスは挑戦のために使用された細菌株によって大きく異なる可能性があります。 P.それは、比較的低い死亡率、より深刻な病変、および高い慢性感染をもたらしたため、 緑膿菌 RP73臨床株はPAO1の参照実験室株よりも好まれた。前臨床試験での薬物検査は、Pで実行する必要がありますシュードモナス株は、長期の慢性感染を確立する際に、それらの高い効率のために選択された。これは科学的な検証と統計解析10,11の要件と一致しているマウスの数を最小限に抑えます。
個々のP.緑膿菌寒天ビーズ調製物は、サイズがおよびCFU / mlで異なります。 A150μmの2×10 7 CFU / mLのverage径が最適であると考えている。ビーズのサイズは、冷却段階（ステップ2.9）中に撹拌速度によって影響される。 <非常にゆっくりと攪拌したものが多く、アモルファスであるが（50μM最高速度で攪拌ビーズ）小さく、球状である（> 1ミリメートル）。挑戦のための最終希釈を調製する際の高い細菌負荷とのそれらが過度に希釈することができるしながら加えて、低細菌負荷とビーズがスティッキーすることができます。過度に希釈されたビーズが、慢性感染がない可能性がありながら、粘着性ビーズを用いたマウスの接種は、原因を犯したすぐに窒息マウスに高い死亡率と関連している。気管内注入の最適な量は50μLですが、最大で100μLの高いボリュームを接種することができる。接種された投与量は5×10 5と5×10 6 CFU /マウスの範囲にあるとき、死亡またはマウスの慢性感染の違いはほとんど見られない。
Appropriat電子細菌増殖培地は、寒天ビーズ形成のために使用されなければならない。この場合には、P.緑膿菌は 、TSAに埋め込 まれた、他の論文は、 バークホルデリアcenocepaciaが栄養ブロス寒天14,15に含まれていた、と報告した。寒天ビーズは、微小コロニー9への単一細胞由来の細菌増殖のための利用可能な必須栄養素でmicroanaerobic環境を提供する必要があります。
呼吸努力は使わ麻酔および用量に応じて異なり、手術後の死亡率に影響を与えます。は0.01mg / g体重の用量で0.1mgの/ g体重のandxylazineケタミンの用量では、最適な選択である。マウスはPで接種した場合に、マウスを、カテーテルと目に見えて浅くを挿管したときの呼吸は正常です緑膿菌寒天ビーズ。理想的には、Pの注入緑膿菌寒天ビーズを50μlの最適な音量でゆっくりと行われるべきである。最大100μLの高いボリュームは高い死亡率につながる可能性マウスの回復に大きな困難。気管内手術によって挑戦すると、すべてのマウスは、十分に感染している。
P.緑膿菌 RP73寒天ビーズに誘導される慢性肺炎は、このモデルでは、感染が多能焦点であり、一般に肺全体を損なうことなく、1つ以上の肺葉を伴うことを示しています。その結果、細菌負荷および炎症反応の評価は、全肺に対して行わなければならない。選択ローブの分析が有効な結果が得られない。マウスの非感染群は、対照として添加し、BAL液中または起因する手順の汚染や間違いに肺の組織学における細胞動員における潜在的な異常を検出する感染マウスと比較すべきである。このモデルは、マウスの観察に適したスキルの訓練を受ける必要があるすべての研究室の担当者とBSL-2実験室で設立されました。立毛、態度：マウスを次のパラメータの1日2回モニターした、歩行、呼吸、好奇心、鼻汁、グルーミング、脱水。 、≥20％の体重を失い、そのようなだらしないコート、不活発、食欲不振、貧しい移動、または痛みを伴う姿勢として、重篤な臨床疾患の証拠を示したマウスは、実験の終了前に安楽死させた。 Pで感染させたマウスPAO1感染マウスと比較した場合、 緑膿菌 RP73寒天ビーズは感染から3日以内に、不快感の低い徴候を示した。この時点以降、いくつかのマウスは、細菌をクリアし、他は28日まで継続する、安定した慢性感染症を発症した。
我々は、この論文で提案する慢性感染のモデルが安定したP.を誘導することができることを実証マウスでの緑膿菌慢性感染症。この方法では、病原体の毒性および宿主防御8,9,16、または抗菌剤および抗炎症性分子10,11の薬物検査のための基礎となる分子メカニズムを研究するために最適化されています。 T適切な動物モデルにおけるこれらの化合物の彼の前臨床検証はCF患者における肺感染症のための将来の治療的介入のために必須である。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
Bragonziの研究室での研究は、イタリアの嚢胞性線維症財団（CFaCore）とEU-F7-2009から223670によって資金を供給されています。この研究の一部は、アレンビック、高度な顕微鏡実験室で行った、マウス組織病理は病理解剖学（サンラファエルバッグ研究所）の単位で行った。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bacto Tryptic Soy Broth | Becton Dickinson | 211823 | |
| Difco Agar, granulated | Becton Dickinson | 214510 | |
| Heavy mineral oil | Sigma-Aldrich | 330760-1L | |
| S-(+)-Ketamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | K1884 | |
| Xylazine hydrochloride | Sigma-Aldrich | X1251 | |
| 1 ml Syringe 25 G 5/8 in 0.5 mm x 16 mm | PIC | 3071250300350 | |
| Catheter 22 G 0.9 mm x 25 mm | Becton Dickinson | 381223 | |
| Graefe Forceps - 0.5 mm Tips Curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Scissors, Iris, 11 cm, straight | World Precision Instruments | 501758 | |
| Suture clips | Fine Science Tools | 12040-01 | |
| Suture thread | Fine Science Tools | 18020-40 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
| Fast-Read 102 Burker disposable chamber | Biosigma | 390497 | |
| Tuerk solution | Fluka | 93770 | |
| RBC lysis buffer | Biolegend | 420301 | |
| Fetal bovine serum | Lonza | DE14-801F | |
| EZ cytofunnel | Thermo Scientific | A78710021 | |
| Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo Scientific | J3800AMNZ | |
| Diff-Quik Romanowsky staining set | Medion Diagnostics | 130832 | |
| Hexadecyltrimethylammonium chloride | Sigma-Aldrich | 52366-10G | |
| 96-well EIA/RIA plate | Costar | 3590 | |
| 3,3’,5,5’- Tetramethylbenzidine | Sigma-Aldrich | T8665-1L | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501-1L | |
| 10% Neutral buffered formalin | Bio-Optica | 05-01005Q | |
| Harris hematoxylin non Papanicolau | Bio-Optica | 05-M06004 | |
| Eosin plus alcoholic solution | Bio-Optica | 05-M11007 | |
| Equipment | |||
| Shaking incubator | Amerex Instruments | Steady Shake 757 | |
| Water bath | Grant | SUB14 | |
| Homogenizer | Ystral | ||
| Precision balance | KERN | 440-47N | |
| Cytocentrifuge | Thermo Scientific | A78300003 | |
| Low Cost Heating Pad | 2biol | LCHP | |
| Homogenization probe | Ystral | 2366925(small) | |
| Inverted optical microscope | Zeiss | Axioplan2 | |
| Camera (microscope) | Zeiss | Axiocam MRc5 | |
| Rotary microtome | Leica | RM2255 | |
References
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