Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Upptäckt av nya intracellulära patogener från Amoebal Coculture och Amoebal anrikning Approaches

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal samodling är ett cellodlingssystem med användning av vidhäftande amöbor att selektivt växa intracellulära patogener kunna motstå fagocytiska celler såsom amöbor och makrofager. Den utgör därmed ett viktigt verktyg för att upptäcka nya smittämnen. Amoebal anrikning möjliggör upptäckten av nya amoebal arter och deras specifika intracellulära bakterier.

Abstract

Intracellulära patogener såsom legionella, mykobakterier och Chlamydia liknande organismer är svåra att isolera, eftersom de ofta växer dåligt eller inte alls på selektiva media som vanligtvis används för att odla bakterier. Av detta skäl är många av dessa patogener har endast nyligen upptäckts eller följande viktiga utbrott. Dessa patogener är ofta förknippade med amöbor, som fungerar som värdcell och tillåta överlevnad och tillväxt av bakterierna. Vi har för avsikt här att tillhandahålla en demonstration av två tekniker som tillåter isolering och karakterisering av intracellulära patogener närvarande i kliniska eller miljöprover: det amoebal samodling och amoebal anrikning. Amoebal samodling möjliggör återvinning av intracellulära bakterier genom att ympa det undersökta provet på en amoebal gräsmatta som kan smittas och lyseras av intracellulära bakterier som finns i provet. Amoebal anrikning möjliggör återvinning av amöbor närvarande i en klinisk eller miljöprov. Thär kan leda till upptäckten av nya amoebal arter men också av nya intracellulära bakterier som växer särskilt i dessa amöbor. Tillsammans utgör dessa två tekniker hjälpa att upptäcka nya intracellulära bakterier som kan växa i amöbor. På grund av deras förmåga att infektera amöbor och motstå fagocytos kan dessa intracellulära bakterier också undkomma fagocytos genom makrofager och därmed vara patogena för högre eukaryoter.

Introduction

Före tillkomsten av molekylär diagnostik, var mikroorganismer som finns i miljö nischer eller i kliniska prover ofta upptäcks genom att odla dem på olika selektiva medier, främst på agar i petriskålar. Fenotypen av de bakteriella kolonierna och deras metaboliska aktivitet tilläts sedan bakteriell klassificering vid artnivå. Buljongen kan också användas för att öka känsligheten för detektering. Däremot behöver båda teknikerna inte tillåta återvinning av bakterier som växer långsamt eller inte alls på dessa medier. Detta är anledningen till att molekylära metoder så ofta används nuförtiden. Ändå upptäckt av DNA ger ingen aning om lönsamheten för bakterierna. Dessutom, i motsats till kultur, molekylära metoder inte leder till en stam som kan kännetecknas vidare.

Studera patogener som växer dåligt på fasta medier eller som behöver cellerna att växa är komplicerat. De flesta av dessa "svårt att växa" bakterier är sparsmakad intracellulära bakterier, ofta upptäcks och kännetecknas efter stora utbrott som det var fallet för Legionella pneumophila. Denna bakterie karakteriserades efter ett utbrott som inträffade under en American Legion konvent. Så många som 182 personer smittades och 29 dog på grund av en svår lunginflammation 1,2. Det senare visade att amöbor var de naturliga värdar för denna bakterie och att deras närvaro i hotellluftkonditioneringssystemet och vattennäten var ursprunget till utbrottet av den så kallade legionärssjuka 3.

Amoebae är närvarande över hela världen och isolerades från jord, luft, vatten och nässlemhinnan av frivilliga försökspersoner (översikt i 4). Dessa "free-living" amöbor i allmänhet dela autonomt i miljön men kan ibland invadera tillåt värdar 5. Amöbor feed på olika mikroorganismer genom fagocytos och efterföljande lysosomala matsmältningen genom hydrolases 6. Många fakultativa eller förpliktigar intracellulära bakterier kan motstå nedbrytning och därmed infektera och dela i amöbor som t.ex. Legionella, Chlamydia-relaterade bakterier eller mykobakterier (över i 7 och 8). Free-levande amöbor sannolikt utgör en viktig potentiell reservoar för intracellulära bakterier som ännu inte har upptäckts. Detta ledde vår grupp att genomföra i Lausanne två huvudsakliga tekniker som kallas amoebal coculture och amoebal anrikning, vilket gjorde olika grupper för att isolera flera nya obligata intracellulära mikroorganismer från olika miljöprover 9-15.

Eftersom amöbor är professionella fagocyter betar på bakterier, kan en bakterie som kan motstå fagocytos och växa inuti dessa protister också kolonisera mänskliga fagocyter och vara patogena mot människor. Detta var delvis visats för vissa Chlamydia-relaterade bakterier, liksom Waddlia chondrophila. W. chondrophila kan växa inte bara i amöbor, men också i ett flertal celltyper såsom däggdjurs epitelceller, makrofager, och fiskcellinjer 16-18. Den amoebal coculture visas också relevant för att detektera intracellulära bakterier i kliniska prover 19,20, inklusive avföring som är starkt förorenade med olika bakteriearter 21.

Här beskriver vi de viktigaste stegen i amoebal coculture och amoebal anrikning, inklusive (a) behandling av miljö-eller kliniska prover, (b) tillväxt av amöbor på axeniska medier och på en bakteriell gräsmatta av Escherichia coli och (c) val och karakterisering av intracellulära bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Amoebal Coculture

1.1 Provberedning

  1. Miljöprov
    1. Vattenprover
      Filtrera provet vatten (500 ml till 1 liter) genom ett 0,22 ^ m porstorlek membran. Därefter, skaka membranet i Sida: s amöba saltmedel PAS (120 mg NaCl, 4 mg MgSO 4 • 7H 2 O, 4 mg CaCl2 • 2 H2O, 142 mg Na 2 HPO 4, och 136 mg av KH 2 PO 4 i 1 liter destillerat vatten).
    2. Fasta prover
      Resuspendera fasta prover som jord eller sand prover och halvfasta prover, såsom aktivt slam i destillerat vatten eller PBS och filtrera dem genom ett 0,22 ìm porstorlek membran. Därefter, skaka membranet i PAS.
    3. Prover starkt förorenade med endogen amöbor och protozoer
      Först sedimentera proverna genom låghastighetscentrifugering (180 x g) for 10 min eller filtrera den genom ett 5 ^ m porstorlek membran. Ytterligare bearbeta supernatanten (respektive Filtrat), som i 1.1.1.
      Obs: Andra saneringstekniker kan användas för att ytterligare sanera miljöprover: Värm provet vid 50 ° C i 30 min eller behandla med sura och basiska lösningar 14.
  2. Kliniska prov
    Process kliniska prover beroende på deras fysikalisk-kemiska egenskaper. Filtrera eller centrifugera vätskor för att avlägsna stora föroreningar. Resuspendera fasta prover. För att använda vävnader, mala dem, till exempel genom användning av en Dounce homogeneiser eller glaspärlor, och lysera cellerna för att frigöra de intracellulära bakterier.

1,2 Amoebae beredning

  1. Broth beredning
    Förbered följande medier: en rik media som innehåller pepton, jästextrakt och glukos (PYG, 100 g proteospepton, 10 g jästextrakt, 4,9 g MgSO 4 • 7H 2O, 5 g natriumcitrat • 2 H2O, 0,1 g Fe (NH4) 2 (SO 4) 2 • 6 H2O, 1,7 g KH 2 PO 4, 1,97 g Na 2 HPO 4 • 7 H2O , 45 g glukos och 0,295 g CaCl2 i 5 liter destillerat vatten) och en icke-närande medium, såsom PAS för Acanthamoeba arter.
  2. Amoebal kultur
    1. Odla amöbor (preferentiellt Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 eller A. polyphaga Linc-Ap1) vid 25 ° C i cellkultur-kolvar innehållande 30 ml PYG-medium.
    2. Skörda amoebae genom kraftig skakning av kolven och centrifugera cellsuspensionen i 10 min vid 1500 x g.. Tvätta pelleten två gånger med PAS-medium. Räkna celler i en Kova sliden och justera volymen för erhållande av en suspension av 5 x 10 5 celler per ml.
    3. Överför amoebal suspensionen i mikroplattor. Använd 1 ml per brunn för 12 - och 24-wELL plattor, 500 | il för 48-brunnsplattor och 300 ul för 96-brunnsplattor. Inkubera mikroplattan under minst 2 h vid 25 ° C. Detta gör att sedimentering och fastsättning av amöborna till botten av varje brunn.

1,3 Coculture

  1. Prov inokulering
    1. Inokulera plattan från 2.3.3 med seriespädningar av provet från 1.1 eller 1.2, vanligen med 10-faldig spädningsserie, som börjar med 100 pl outspätt prov.
    2. Centrifugera mikroplattan vid 1800 xg under 10 min till sediment på amoebal gräsmatta mikroorganismerna potentiellt närvarande i provet. Detta ökar kontakten och fagocytos av mikroorganismer genom amöbor.
    3. Inkubera plattorna under 45 min vid 25 ° C och tvättas tre gånger med PAS genom att ersätta mediet med färskt PAS. Lägg 1 ml per brunn av PAS med eller utan tillsats av antibiotika (streptomycin, penicillin, gentamicin och / eller vancomycin), beroende på bacterial arter som sökte efter.
    4. Inkubera med mikroplattor vid 32 ° C i en fuktig atmosfär för att undvika encystment av amöbor. Observera var väl dagligen med en 20X mål att påvisa förekomsten av bakterier som invaderar och lyser amöbor.
    5. I fallet med lys, utför en subkultur på färsk amöbor genom inokulering av 100 pl av samodlingar till ett monoskikt av ca 10 5 amöbor / cm 2. För att specifikt isolera en given bakterieart, ympa också specifika agar media avsett för dessa bakterier (dvs. BCYE agar för Legionella spp..).
    6. I frånvaro av lys, ta 100 pl av samodlingar 4-7 dagar efter den första ympningen och inokulera en färsk amoebal kultur av 900 | il i en 24-brunnsplatta. Om snabb lys av amöbor observeras utan spridning av bakterier, kan virus vara närvarande. I detta fall välja supernatanten vid 0,22 ^ m och använd den filtrerade suspensionen för att infektera färska amöbor.

    1,4 Bakteriell isolering och karakterisering

    1. Bakteriell färgning
      Utför samodlingar direkt på täckglas i 24 mikrobrunnar. Ta ut mediet och utföra färgning eller immunofluorescens.
      1. Modifierad Romanowsky färgning
        1. Låt täck torr. Doppa täck fem gånger i fixeringslösning (2 mg / L Fast Green i metanol).
        2. Doppa täck fem gånger i färglösningen I (1,22 g / L Eosin G i fosfatbuffert pH 6,6)
        3. Slutligen, sänk ned täck 5 gånger i färglösningen II (1,1 g / L tiazm i fosfatbuffert pH 6,6).
        4. Skölj provet med destillerat vatten. Låt torka och observera i mikroskop.
      2. Ziehl-Neelsen färgning
        1. Låt täck torr. Täck provet med Ziehl fuksin. Värm färgen med en låga tills ångorna visas.
        2. Kyl vid rumstemperatur under åtminstone 5 minoch skölj med destillerat vatten. Täck provet med 3% klorvätesyralösning i isopropanol under 2 min och sköljdes med destillerat vatten.
        3. Lock för 30 sek med metylenblått och skölj med destillerat vatten. Låt torka och observera i mikroskop 22.
      3. Gimenez-färgning
        1. Bered en basisk fuchsin förrådslösning genom att blanda 100 ml av 10% basisk fuchsin (10 g basiskt fuksin i 100 ml 95% etanol), 250 ml 4%-ig vattenhaltig fenol och 650 ml destillerat vatten. Inkubera vid 37 ° C under 48 h före användning.
        2. Låt täckglaset torka och fixera det genom att passera den genom lågan. Täck provet med nyligen filtrerad basisk fuchsin (4 ml basisk fuchsin stamlösning i 10 ml av 0,1 M natriumfosfatbuffert, pH 7,45) under 2 min.
        3. Skölj provet med vatten och inkubera i malakitgrönt (0,8% i destillerat vatten) i 10 sek. Skölj igen med vatten och upprepa malakitgrönt färgning. Skölj en gång med vatten. Låt täck torr, mount det, och observera i mikroskop 23.
      4. Immunofluorescens
        1. Fäst täckglas genom inkubering i metanol under 5 min eller med paraformaldehyd 4% under 10 min.
        2. Tvätta tre gånger med PBS och inkubera i 2 tim i blockeringslösning (5% BSA, 0,1% Saponin i PBS) vid rumstemperatur.
        3. Inkubera täckglas under 1 timme i blockeringslösning innehållande antikroppar alstrade mot den mikroorganism som är av intresse.
        4. Tvätta igen tre gånger i PBS och inkubera under 1 timme med en sekundär antikropp som är riktad mot den primära antikroppen och kopplas till en fluorofor. Tvätta tre gånger med PBS, montera täckglas och observera genom fluorescensmikroskopi.
    2. DNA-detektion genom PCR
      Extrahera DNA från 100 till 200 | il av amoebal samodling. Identifiera mikroorganismer med universella primers riktade 16S rRNA genen eller specifika primers för arter av intresse såsom mykobakterier 24, Legionella 25 eller medlemmar av Chlamydiales 26.

    2. Amoebal Anrikning

    2,1. Provberedning

    Resuspendera fasta och halvfasta prover i PAS genom virvelbildning. Centrifugera suspensionen vid låg hastighet (180 x g) under 10 min. Detta möjliggör anrikning av fritt levande amöbor i pelleten. Den överstående lösningen kan användas för amoebal samodling och pelleten för amoebal anrikning 21.

    2.2. Medel beredning

    1. Tillsätt 1,5 g agar till 100 ml av PAS och autoklavera mediet 15 min vid 121 ° C. Häll varmt medium i petriskålar och låta stelna vid rumstemperatur.
    2. Väx Escherichia coli (ATCC 25922) i LB eller tioglykolat buljong över natten vid 37 ° C. Tvätta bakterierna två gånger med PBS och återsuspendera dem i PAS-medium. Späd 10x i PAS och spred 2-3 ml av denna spädning på en PAS agarplatta och låt torka.

    Tillsätt en droppe av provet (eller en bit-filter) på en sida av plattan och låta den strömma över Petri-skål för att bilda en linje i mitten av skålen.

    2,4. Amoebal tillväxt och amoebal subkultur

    1. Beakta petriskålens dagligen. Om en amoebal migration front upptäcks, skära ut en liten bit av agar vid migrations fram och ympa en fräsch NNA petriskål täckt med en matta av E. coli.
    2. Upprepa reinoculation flera gånger beroende på renheten av provet, för att få en ren kultur av en given amoebal stam.

    2,5. Amoebae och bakterier karakterisering

    1. Skrapa cellerna och resuspendera dem i PAS.
    2. Extrahera DNA och bestämma identiteten av amöbor och / eller bakteriella endosymbionts genom PCR och sekvensering (16S rRNA-amplifiering för bakterier, resp. 18S rRNA för amöbor och sekvensering, till exempel).
      3. <li> Använd dessa skrapade celler i PAS att ympa färska amöbor och utföra en amoebal coculture att upptäcka bakterier som eventuellt finns i provet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Använda amoebal coculture och amoebal anrikning, var en rad miljö-och / eller patogena bakterier upptäcktes (Tabell 1).

Amoebal coculture användes av vår grupp och andra att analysera miljöprover, reningsverk och distributionssystem vatten. Ett brett spektrum av mikroorganismer kunde isoleras med denna teknik. De vanligaste bakterierna som isolerats från amoebal coculture är medlemmar i Mycobacterium släktet som kan återvinnas från reningsverk och från vattennäten 13,14,24,27,28. Legionella och α-Proteobacteria arter kan också isoleras från reningsverk och från sjukhus vattennät 14,24,28-31. Flera Chlamydia-besläktade arter också isolerad från flodvatten och vattenreningsanläggningar, som till exempel Estrella lausannensis (figur 2B-C 12,15,32,33.

34-36. Dessa virus är alla möjlighet att infektera och föröka sig i amöbor och presentera en solförmörkelse fas typiskt för deras viral livsstil. De mimivirus betraktas som en mild mänsklig lung patogen eftersom det var inblandad i en oavsiktlig infektion av en laboratorietekniker som led av lunginflammation 37. Potential patogenicitet av andra jätte virus behöver fortfarande utredas.

Amoebal berikning användes ofta parallellt med amoebal samodling. Således, när man undersöker ett vattenreningsverk systemet och nedströms vattennätet, 25 olika amoebal stammar har upptäckts, varav 12 motsvarade nya arter 14. Amöbor var närvarande vid varje steg av vattenrening och distribution, vilket tyder på ett motstånd av dessa protister till ozonering och klorering. Intracellulära bakterier could också påvisas i dessa amöbor, visar betydelsen av inhemska amöbor i överföringen av intracellulära bakterier 14. I en annan studie kunde amöbor isoleras från systemet på ett sjukhus 24 vattendistribution. En stor majoritet av de stammar som isolerats i denna studie motsvarade Hartmannella vermiformis vilket naturligtvis kunna överleva vid relativt höga temperaturer. Flera bakterier, såsom Legionella pneumophila kunde detekteras i den inhemska amöbor 24. Ett annat exempel på bakterier som finns i ett visst amöba är Parachlamydia acantamoebae. Denna Chlamydia relaterade bakterien isolerades från nässlemhinnan kvinnliga frivilliga med amoebal anrikning (Figur 2A) 9 och är en potentiell agent för lunginflammation 38. Detta visar återigen hur viktigt det är amöbor i underhåll och spridning av bakteriella patogener som kan vara speciellt patogena för immunocompromised patienter 39.

Figur 1
Figur 1. Disposition av amoebal coculture och amoebal anrikning som beskriver de viktiga stegen i dessa två tekniker. (Från 40). Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Exempel på bakterier som upptäcktes av amoebal samodling och deras observation med olika färgningsmetoder. A) Infärgning av Parachlamydia acanthamoebae Halls coccus infekterar amöbor med modifierad Romanowsky metod 24 h efter infektion med en förstoring av 1000 X. Bakterier är färgade i blått (enrrows). f.Kr.) Elektronmikroskopi av Estrella lausannensis visar typiska stjärnan morfologi av elementära kroppar (pilar).

Tabell 1. Exempel på bakterier från olika klasser upptäcktes av amoebal coculture.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amoebal coculture och amoebal anrikning är effektiva metoder som tillät isoleringen av många nya bakterie-och amoebal arter. Resultat som erhållits med dessa metoder bekräftar den allestädes närvarande både amöbor och amöbabeständiga bakterier i miljön, och mest intressant i konstgjorda vattennätverk som anses styras av kemiska behandlingar såsom klorering och ozonering. Amoebal coculture och amoebal anrikning är viktiga verktyg för att isolera och odla dessa potentiellt patogena mikroorganismer och att få stammar i ren kultur för att sedan ytterligare studera deras biologi och patogenicitet. Nyligen har denna metod anpassad för hög genomströmning isolering av gigantiska virus 41. På samma sätt kan amoebal coculture automatiseras och användas som ett rutin teknik för att testa mikrobiologiska kvaliteten av prover miljö och konstgjorda vattensystem, såsom dricksvatten.

Amoebal samodling kanutföras med olika arter av amöbor. Vi brukar föredra att använda Acanthamoeba castellanii eller A. polyphaga eftersom de är mindre benägna att encystment än Hartmannella vermiformis och eftersom de uppvisar ett relativt stort värdspektrum. Andra arter kan användas men protokollet och buljong bör anpassas. Det har nyligen visats att A. lenticulana (ATCC 30841) kan användas på samma villkor som A. castellanii eller A. polyphaga men har olika känslighet för infektioner 42. För att förhindra encystment, är det viktigt att använda en relativt låg inkubering i rumstemperatur (under 30 ° C) och för att bibehålla en fuktig atmosfär.

Anmärkningsvärt, kommer den ihållande replikering av amoebal symbionter inte nödvändigtvis leda till amoebal lys och då specifikt letar efter symbionter, bör systematiskt genomföras screening av mikroskopi och / eller PCR. För att undvika lys eller lossnar amoebal ce lls grund av bakteriell överväxt är det användbart att utföra ympningen av starkt förorenade prover med användning av 10-faldiga seriespädningar.

Men dessa tekniker har begränsningar. På grund av användningen av en enda amoebal arter, kan amoebal samodling inte tillåta isolering av bakterier som använder som behållare ytterligare amoebal arter. Dessutom kan sådana särskilda amoebal arter inte kan föröka sig på E. coli gräsmattor och kan missas av amoebal anrikning. Beroende på egenskaperna hos de bakterier eller amöbor som undersökts, kan det vara nödvändigt att testa olika medier, olika amoebal arter och olika bakteriearter att mata amöbor (Enterobacter doacae och några Pseudomonas-stammar är bra alternativ). Bakteriell förorening av amöbor eller media som används för amoebal coculture kan förekomma och kan leda till falskt positiva resultat. En negativ kontroll är således obligatoriskt att undvika sådana falskt positiva resultat.

innehåll "> Sammanfattningsvis amoebal coculture och amoebal anrikning är två kompletterande tillvägagångssätt som representerar intressanta verktyg för att specificera ekologi och biologisk mångfald av frilevande amöbor och amöbor beständiga bakterier. Dessa tekniker tillåter upptäckten av många nya arter, bland amöbor, bakterier och jätte virus, som ligger till grund för framtida studier för att undersöka patogeniteten av dessa nya mikroorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Pr. Bernard La Scola för hjälp tekniska råd och intressant diskussion om amoebal coculture och amoebal anrikning. Vi tackar också Dr Vincent Thomas för hans hjälp i genomförandet av tekniken i vårt laboratorium.

Materials

Klass Sort exempel Referens
α-proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
b-proteobacteria Burkholderia cepacia 36
g-proteobacteria Legionella drancourtii 26
Chlamydiae Estrella lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Aktinobakterier Mykobakterier spp.. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

Immunologi Environmental Microbiology Mark Mikrobiologi vatten Mikrobiologi Amöbor mikroorganismer samodling obligat intracellulära bakterier
Upptäckt av nya intracellulära patogener från Amoebal Coculture och Amoebal anrikning Approaches
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter