Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Amoebal kokültürü ve Amoebal Zenginleştirme Yaklaşımlar New hücre içi patojenlerin keşif

Published: October 27, 2013 doi: 10.3791/51055
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Institute of Microbiology, University Hospital Center and University of Lausanne

Summary

Amoebal kokültürü seçici gibi amip ve makrofajlar gibi fagositik hücrelere karşı mümkün hücre içi patojenleri büyümesi yapışık amipler kullanarak bir hücre kültür sistemi. Bu yüzden, yeni enfeksiyöz ajanlar keşfetmek için önemli bir aracı temsil eder. Amoebal zenginleştirme amoebal yeni türlerin ve bunların özel hücre içi bakteri keşfini sağlar.

Abstract

Bu tür Legionella, mikobakteriler ve Chlamydia benzeri organizmalar olarak hücre içi patojenler genellikle tüm genellikle bakteri yetiştirmek için kullanılan seçici ortam üzerinde zayıf ya da büyür, çünkü izole etmek zordur. Bu nedenle, bu patojenlerin çoğu sadece son zamanlarda keşfedilen veya önemli salgınlar takip edildi. Bu patojenler genellikle konakçı hücre olarak görev yapar ve bakterilerin hayatta kalması ve büyümesi sağlayan amip ile ilişkilidir. Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme: Biz klinik veya çevre örneklerinde hücre içi patojenlerin izolasyonu ve karakterizasyonu mevcut izin iki teknik bir gösteri sunmak için buradayız niyetinde. Amoebal kokültürü numunede mevcut olan hücre içi bakteri tarafından enfekte edilmiş ve lize edilebilir bir amoebal çim üzerine aşılanması ile incelenen örnek, hücre içi bakterilerin iyileşme sağlar. Amoebal zenginleştirme klinik ya da çevresel örneklemde amip kurtarma mevcut sağlar. Thama aynı zamanda bu amip özellikle büyüyen yeni hücre içi bakteri yeni amoebal türlerin keşfine yol açabilir edilir. Birlikte, bu iki teknik amip büyümek mümkün yeni hücre içi bakteri keşfetmek için yardımcı olur. Çünkü amipler enfekte ve fagositoz karşı yetenekleri nedeniyle, bu hücre içi bakteri da makrofajlar tarafından fagositoz kaçış olabilir ve bu nedenle, daha yüksek ökaryotlar için patojenik.

Introduction

Moleküler tanı gelişiyle önce, çevre nişler ya da klinik örneklerde mevcut mikroorganizmalar genellikle ağırlıklı Petri yemekleri ağar üzerinde, farklı seçici medya yetiştirilmesi tarafından tespit edildi. Bakteri kolonileri ve bunların metabolik aktivite fenotip daha sonra türler düzeyinde bakteri sınıflandırma izin verdi. Et suyu, aynı zamanda algılama hassasiyeti arttırmak için kullanılabilmektedir. Ancak, her iki teknik de bu ortama yavaş ya da büyür bakterilerin kurtarma izin yoktur. Bu moleküler yaklaşımlar çok yaygın günümüzde kullanılan nedeni budur. Bununla birlikte, DNA tespiti bakterilerin canlılığı üzerindeki herhangi bir ipucu sağlar. Ayrıca, aksine kültüre, moleküler yaklaşımlar daha fazla karakterize edilebilir bir suş içerisinde sonuçlanmaz.

Büyümeye katı ortam ya da ihtiyaç hücreleri üzerinde zayıf büyüyecek patojenlerin incelenmesi karmaşıktır. Bunların çoğu bakteriler titiz intr olan "zor büyümek"aselüler bakteriler, genellikle keşfedilen ve Legionella pneumophila için olduğu gibi büyük salgınlar sonrasında karakterizedir. Bu bakteri bir Amerikan Lejyonu kongre sırasında meydana gelen bir salgın aşağıdaki karakterize edildi. Birçok 182 olarak kişi enfekte ve 29 nedeniyle ağır pnömoni 1,2 ölmüştür. Daha sonra amip doğal bu bakterinin ana ve otel klima sistemi ve su şebekelerinde onların varlığı sözde Lejyoner hastalığının 3 salgının kökeni olduğunu olduğu gösterilmiştir.

Amipler dünya çapında bulunur ve toprak, hava, su ve (4 gözden), insan gönüllülerin burun mukozasından izole edilmiştir. Bu "serbest yaşayan" Amiblerden genellikle ortamında özerk bölünmesi ama bazen müsamahakar ana 5. istila edebilir. Hy tarafından fagositoz ve sonraki lizozomal sindirim yoluyla çeşitli mikroorganizmalar üzerinde Amip beslemedrolases 6. Birçok fakültatif veya zorunlu hücre içi bakteri sindirim direnmek ve böylece bulaştırmak ve örnek Legionella, Chlamydia ilişkili bakteriler veya mikobakteriler gibi amip bölmek (7 gözden ve 8) edebiliyoruz. Serbest yaşayan amipler olasılıkla henüz keşfedilmiş değil hücre içi bakteriler için önemli bir potansiyel rezervuar temsil eder. Bu Lozan'da farklı gruplar çeşitli çevresel örneklerde 9-15 birkaç yeni zorunlu hücre içi mikroorganizmaları izole etmek için izin amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme denilen iki ana tekniklerini uygulamak, bizim grup yol açtı.

Amip bakteriler üzerinde otlatma profesyonel fagositlerdir yana, fagositoz direnmek ve bu protistler içinde büyümek mümkün bir bakteri aynı zamanda insan fagositler kolonize ve insanlara karşı patojenik olabilir. Bu, kısmen, Waddlia CHO gibi bir Chlamydia ile ilgili bakteriler için gösterilmiştirndrophila. W. chondrophila amip değil, aynı zamanda örneğin memeli epitel hücreleri, makrofajlar ve balık hücre hatları 16-18 gibi çeşitli hücre tiplerinde, sadece büyüyebilir. Amoebal kokültürü da ağır farklı bakteri türlerinin 21 ile kontamine dışkı gibi klinik örneklerde 19,20, hücre içi bakterilerin saptanması için ilgili görünür.

Aksenik ortam üzerinde amip (b) büyüme ve Escherichia coli bakteriyel çim ve (c) seçimi ve karakterizasyonu; Burada çevresel veya klinik örneklerin (a) tedavisi dahil olmak üzere, ortak kültürü amoebal ve amoebal zenginleştirme en önemli adımları açıklar hücre içi bakteri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Amoebal Coculture

1.1 Numune hazırlama

  1. Çevre örnek
    1. Su örnekleri
      0.22 mikron gözenek boyutlu zar boyunca su örnek (1 L için 500 mi) filtre. Sonra, (Page'in amip tuzlu orta PAS zarı sallamak NaCl 120 mg, MgSO 4 4 mg • 7H 2 O, CaCl 2 4 mg • 2H 2 O, Na 2 HPO 4 142 mg, ve KH 136 mg damıtılmış su, 1 L 2 PO 4).
    2. Katı örnekler
      Damıtılmış su veya PBS içinde aktif çamur gibi kir veya kum örnekleri ve yarı-katı numuneler gibi katı örneklerin yeniden süspanse edin ve 0.22 um gözenek boyutlu zar aracılığıyla filtre. Daha sonra, PAS olarak membran sallayın.
    3. Yüksek endojen amip ve protozoa kontamine numuneler
      İlk düşük hızda santrifüj (180 xg) fo tarafından örnekleri sedimentr 10 dakika ya da bir 5 um gözenek boyutu membrandan filtre. Bundan başka 1.1.1 olarak, süpernatan (sırasıyla Süzüntü) işlem.
      Not: 30 dakika boyunca 50 ° C'de ısıtın örnek veya asidik ya da bazik çözeltiler 14 ile tedavi: diğer arındırma teknikleri daha çevre örnekleri temizlemek için kullanılabilir.
  2. Klinik örnek
    Kendi fiziko-kimyasal özelliklerine bağlı olarak, klinik örnekleri işleyin. Büyük kirleri çıkarmak için filtre veya santrifüj sıvılar. Katı örnekleri süspanse edin. , Doku kullanımı bir Dounce homogeneiser veya cam boncuklar kullanılarak, örneğin, onlara eziyet, hücre içi bakteri ve boşaltmak için, hücreleri parçalamak için.

1.2 Amip hazırlık

  1. Et suyu hazırlama
    ; Proteoz pepton, 100 g maya ekstresi, 10 g, MgSO 4 • 7H 2'nin 4.9 g pepton, maya özütü ve glikoz (PYG ihtiva eden bir zengin ortam: Aşağıdaki ortamını hazırlayınO, sodyum sitrat 5 g • 2H 2 O, Fe (NH4) 0.1 g 2 (SO4) 2 • 6H 2 O, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4, 1.97 g, 1.7 g • 7H 2 O , glukoz 45 g, ve distile su 5 L CaCI2 0.295 g) ve bu Acanthamoeba türler için PAS gibi besleyici olmayan ortamı.
  2. Amoebal kültür
    1. PYG ortamı 30 ml ihtiva eden hücre kültürü şişelerinde 25 ° C'de amipler (tercihen Acanthamoeba castellanii ATCC 30010 veya A. polyphaga Linc-Ek 1) geliştirin.
    2. Şişenin sert bir şekilde sallama ile amipler hasat ve 1500 x g 10 dakika boyunca hücre süspansiyonu santrifüj. PAS ortamı ile iki kez pelet yıkayın. Bir Kova slayt hücreleri saymak ve ml başına 5 x 10 5 hücre süspansiyonu elde etmek için ses seviyesini ayarlayın.
    3. Mikroplakalar içine amoebal süspansiyonu aktarın. Ve 24 w 1 - 12 için kuyu başına ml kullanınell plakalar, 48-yuvalı plakalar ve 96-yuvalı plakalar 300 ul için 500 ul. 25 ° C'de en az 2 saat boyunca inkübe mikroplak Bu iyi sedimantasyon ve amip bağlanma her alt sağlar.

1.3 Coculture

  1. Örnek aşılama
    1. Seyreltilmemiş numune 100 ul ile başlanarak, genellikle 10-kat seyreltme serisi ile, 1.1 veya 1.2 'den örnek seri seyreltileri ile 2.3.3 gelen plaka inoküle.
    2. Numune içindeki mikroorganizmaların potansiyel olarak amoebal çim tortu, 10 dakika boyunca 1800 x g'de santrifüje mikroplak. Bu amip tarafından temas ve mikroorganizmaların fagositozu artırır.
    3. 25 ° C 'de 45 dakika boyunca inkübe edilir ve taze PAS ile ortam değiştirerek PAS ile üç kez yıkayın. Bakteri oluşumuna bağlı olarak (streptomisin, penisilin, gentamisin ve / veya vankomisin) veya antibiyotik ilave edilmeden PAS oyuk başına 1 ml, eklemearanır al türler.
    4. Amip bir kese içine alma önlemek için nemli bir atmosferde 32 ° C'de inkübe mikroplak. Amipler istila ve lize bakteri varlığını tespit etmek için bir 20x objektif ile günlük olarak her biri de dikkate alınmalıdır.
    5. Lizis durumunda, yaklaşık 10 5 amipler / cm 2 arasında bir tek tabaka ile alt kültürleri olarak 100 ul inokülasyon taze amip bir alt kültür gerçekleştirin. Özellikle verilen bir bakteri türünü izole etmek, bu bakterilerin (Legionella spp yani BCYE agar.) Için tasarlanmış özel ağar medya da aşılamak.
    6. Liziz yokluğunda, 4-7 gün, ilk aşılamadan sonra alt kültürleri olarak, 100 ul almak ve bir 24 oyuklu bir plaka içerisinde 900 ul taze bir amoebal kültürü inoküle. Amip hızlı liziz bakterilerin çoğalması olmadan gözlenirse, bir virüs mevcut olabilir. Bu durumda, 0.22 um'lik filtre ile süpernatan ve taze amipler bulaştırmak için süzüldü süspansiyon kullanmak.

    1.4 Bakteriyel izolasyon ve karakterizasyonu

    1. Bakteriyel boyama
      Mikroplakalar 24 kuyuda cam lamelleri doğrudan cocultures gerçekleştirin. Ortamı çıkarın ve boyama veya immünofloresan gerçekleştirin.
      1. Modifiye Romanowsky boyama
        1. Lamel kurumasını bekleyin. Lamel fiksatif solüsyonu (2 mg / L Hızlı Yeşil metanol) beş kez daldırın.
        2. Boyama çözeltisi içinde beş kez lamel daldırın I (1.22 g / L Eosine G fosfat tamponu pH 6.6)
        3. Son olarak, boyama çözeltisi II (fosfat tamponu pH 6.6 içinde 1.1 g / L tiazin) 'de lamel 5 kez bırakın.
        4. Damıtılmış su ile örnek durulayın. Kuruması ve mikroskobu ile gözlemlemek.
      2. Ziehl-Neelsen boyama
        1. Lamel kurumasını bekleyin. Ziehl fuksin ile örnek örtün. Buharlar ortaya çıkıncaya kadar bir alev ile boya ısıtın.
        2. En az 5 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumayave distile su ile durulayın. 2 dakika süreyle izopropanol içinde% 3 hidroklorik asit çözeltisi ile örnek örtün ve damıtılmış su ile yıkayın.
        3. Metilen mavisi ile 30 saniye için Kapak ve distile su ile durulayın. Kuruması ve mikroskopi 22 ile gözlemlemek.
      3. Gimenez boyama
        1. 100% 10 bazik fuksin ml (100 ml,% 95 etanol içinde bazik fuksin 10 g), 250 ml% 4 sulu fenol ve damıtılmış su, 650 ml karıştırılarak bir bazik fuksin stok çözelti hazırlayın. Kullanımdan önce 48 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir.
        2. Lamel alev geçirilerek kuru ve düzelteyim. 2 dakika boyunca (10 ml 0.1 M sodyum fosfat tampon maddesi, pH 7.45 olarak bazik fuksin stok çözeltisi 4 mi), henüz süzüldü bazik fuksin ile örnek örtün.
        3. Su ile durulayın ve örnek 10 saniye boyunca malakit yeşil (distile su içinde% 0.8) inkübe edilir. Tekrar su ile durulayın ve malakit yeşil lekelenme tekrarlayın. Tekrar su ile yıkayın. Lamel kurumaya bırakın, mBunu ount ve mikroskopi 23 ile gözlemlemek.
      4. İmmünofloresan
        1. 10 dakika boyunca% 4, 5 dakika için ya da paraformaldehid ile metanol içinde inkübe edilerek lamel sabitleyin.
        2. PBS ile üç kez yıkanır ve oda sıcaklığında (PBS içinde% 0.1 saponin,% 5 BSA) bloke etme çözeltisi 2 saat boyunca inkübe edilir.
        3. Ilgi konusu mikroorganizmanın karşı oluşturulan antikorlar ihtiva eden bloke etme çözeltisi içinde 1 saat boyunca inkübe lamel.
        4. PBS içinde tekrar üç kez yıkayın ve birincil antikor karşı ve bir florofor ile bağlantılı ikinci bir antikor ile 1 saat boyunca inkübe edilir. PBS ile üç kez yıkayın, lamel montaj ve floresan mikroskobu ile gözlemlemek.
    2. PCR ile DNA tespiti
      Amoebal birlikte-kültür, 100 ila 200 ul DNA ekstrakte edin. Bu tür mikobakteri 24 gibi ilgi türler için 16S rRNA geni ya da spesifik primerlerin hedef evrensel primerler ile mikroorganizmaların Algılama, Legionella 25 ya da 26 Chlamydiales üyeleri.

    2. Amoebal Zenginleştirme

    2.1. Örnek hazırlanması

    Vorteks tarafından PAS katı ve yarı-katı örneklerin tekrar. 10 dakika için düşük hızda (180 xg) de süspansiyonu santrifüj. Bu pelet serbest-yaşayan amip zenginleştirme sağlar. Süpernatan amoebal ortak kültürü ve amoebal zenginleştirme 21 için pelet için kullanılabilir.

    2.2. Orta hazırlık

    1. PAS, 100 ml agar 1.5 g eklenir ve 121 ° C'de 15 dakika ortam otoklav Petri tabaklarında sıcak orta dökün ve oda sıcaklığında katılaşan sağlar.
    2. 37 ° C de bir gece boyunca LB suyu ya da tioglikolat in Escherichia coli (ATCC 25922) büyümek PBS ile iki kez yıkanır ve bakteri PAS ortamı içine tekrar süspansiyon. PAS 10x sulandırmak ve PAS agar plaka üzerinde bu seyreltme 2-3 ml yayılır ve kurumaya bırakın.

    Plaka bir tarafında örneğin bir damla (veya filtre bir parça) ilave edilir ve bu çanak merkezinde bir çizgi oluşturacak şekilde Petri çanağı üzerinde akış sağlar.

    2.4. Amoebal büyüme ve amoebal altkültür

    1. Günlük Petri gözlemleyin. Bir amoebal göç ön tespit edilirse, göç ön agar küçük bir parça kesip ve E. bir çim ile kaplı taze NNA Petri aşılamak coli.
    2. Verilen amoebal soyunun saf kültür elde etmek için, numunenin saflığı bağlı olarak reinoculation birkaç kez tekrarlayın.

    2.5. Amip ve bakteri karakterizasyonu

    1. Hücreleri kazıyın ve PAS bunları tekrar süspansiyon.
    2. Özü DNA ve PCR ve dizileme (bakteriler için 16S rRNA amplifikasyon, resp. 18S rRNA amip ve dizileme için, örneğin) ile amip ve / veya bakteriyel endosimbiyont kimliğini belirler.
      3. <li> taze amipler aşılamak ve numunede muhtemelen mevcut bakteri tespit etmek için, bir birlikte-kültür amoebal gerçekleştirmek için PAS bu hücreler kazınmış kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme kullanarak, çevresel ve / veya patojenik bakterilerin bir dizi (Tablo 1) keşfedildi.

Amoebal kokültürü çevre örnekleri, su arıtma tesisleri ve su dağıtım sistemleri analiz etmek bizim grup ve başkaları tarafından kullanılmıştır. Mikroorganizmaların geniş bir yelpazede bu teknik ile izole edilebilir. Amoebal kokültür izole en yaygın bakteri su arıtma tesislerinden ve su şebekeleri 13,14,24,27,28 kurtarıldı olabilir Mycobacterium cinsinin üyeleridir. Legionella ve α-Proteobacteria türler aynı zamanda su arıtma tesisleri izole edilebilir ve hastane su şebekeleri 14,24,28-31 dan. Çeşitli Chlamydia ile ilişkili türler aynı zamanda, örneğin Estrella lausannensis (Şema 2B-C 12,15,32,33 gibi, nehir suyu ve su arıtma tesisleri izole edilmiştir.

34-36 olarak bulunmuştur. Bu virüsler, tüm enfekte ve çarpma amip içinde ve onların viral yaşam tarzının tipik bir tutulma aşaması sunmak için edebiliyoruz. Pnömoni 37 muzdarip bir laboratuvar teknisyeni, bir kaza sonucu enfeksiyon karışmıştı yana mimivirus hafif bir insan akciğer patojeni olarak kabul edilir. Diğer dev virüslerin potansiyel patojenik hala incelenmesi gerekir.

Amoebal zenginleştirme genellikle ortak kültürü amoebal paralel olarak kullanılmıştır. Bir su arıtma tesisi sistemi ve mansap su şebekesi hakkında soruşturma Böylece, 25 farklı amoebal suşları 12 yeni türlerin 14 karşılık olan, tespit edilmiştir. Amip ozonlama ve klorlama bu protistler bir direnç gösteren, su arıtma ve dağıtımın her aşamasında hazır bulundu. Hücre içi bakteri coULD da hücre içi bakterilerin 14 iletilmesinde yerli amip önemini gösteren, bu amip saptanabilir. Bir başka çalışmada, amipler bir hastane 24 su dağıtım sisteminden izole edilebilir. Bu çalışmada, izole edilen suşların büyük bir çoğunluğu, doğal olarak nispeten yüksek sıcaklıklarda hayatta mümkün olan Hartmannella vermiformis karşılık geldi. Örneğin Legionella pneumophila gibi çeşitli bakteriler, yerli amip 24 tespit edilebilir. Belirli amip bulunan bir bakteri başka bir örneği Parachlamydia acantamoebae olduğunu. Bu Chlamydia ile ilişkili bakteri amoebal zenginleştirme (Şekil 2A) ile 9 dişi gönüllüler burun mukozasından izole edilmiş ve pnömoni 38 potansiyel bir ajandır. Bu da yine immunocompromis özellikle patojenik olabilir bakteriyel patojenlerin bakım ve dispersiyon içerisinde amip önemini göstermektedir39 hasta ed.

Şekil 1
Şekil 1. Amoebal kokültürü ve bu iki tekniğin önemli adımlar açıklayan amoebal zenginleşme Anahat. (40 uyarlanmıştır). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2,
Şekil 2. 1000 X büyütme ile enfeksiyon sonrası modifiye Romanowsky yöntemi 24 saat, ile Parachlamydia acanthamoebae Hall'un koklar bulaştırma amip ve amoebal kokültürü ve farklı boyama yöntemleri ile gözlem tarafından keşfedilen bakteri örnekleri. A) Boyama Bakteriler (mavi lekeli birEstrella rrows). BC) Elektron mikroskobu temel organları (oklar) tipik yıldızı morfoloji gösteren lausannensis.

Tablo 1. Amoebal ortak kültürü ile keşfedilen farklı sınıflardan, bakteriler, örneğin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme birçok yeni bakteriyel ve amoebal türlerin izole izin etkili yöntemlerdir. Bu yöntemler ile elde edilen sonuçlar amip ve ortamda amip dirençli bakterilerin hem her yerde varlığını doğrulamak, ve en ilginci böyle klorlama ve ozonlama gibi kimyasal tedaviler ile kontrol olarak kabul edilir sentetik su şebekelerinde. Amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme yalıtmak ve yetiştirmek bu potansiyel patojen mikroorganizmalar ve daha sonra da biyoloji ve patogenikliğe incelemek amacıyla saf kültür suşları elde etmek için gerekli araçlardır. Son zamanlarda, bu yöntem, dev virüs 41 arasında yüksek verimli izolasyonu için uyarlanmıştır. Benzer şekilde, amoebal kokültürü otomatik ve çevresel örneklerde ve içme suyu gibi suni su sistemleri, mikrobiyolojik kalitesini test etmek için bir rutin tekniği olarak kullanılmış olabilir.

Amoebal kokültürü canamip farklı türleri ile gerçekleştirilebilir. Biz genellikle Acanthamoeba castellanii veya A'yı kullanmayı tercih bunlar nispeten büyük bir konak spektrumu sergilerler çünkü onlar Hartmannella vermiformis daha kese içine alma daha az yatkındır ve beri polyphaga. Diğer türler kullanılabilecek ancak protokol ve suyu adapte edilmelidir. Son zamanlarda gösterilmiştir ki, A. lenticulana (ATCC 30841) A. ile aynı koşullar kullanılabilir castellanii veya A. polyphaga ancak enfeksiyon 42 karşı farklı duyarlılığa sahiptir. Kese içine alma önlemek için, (30 ° C altında), nispeten düşük bir inkübasyon sıcaklığı kullanmak ve nemlendirilmiş bir atmosferi korumak için önemlidir.

Dikkate değer, amoebal simbiyontları ve sürekli çoğaltma mutlaka amoebal çözünmeye neden olmayacak ve özellikle simbiyontları ararken, mikroskopi ve / veya PCR ile tarama sistemli yapılmalıdır. Amoebal ce parçalanma veya ayrılmasını önlemek için LLS bakteriyel büyüme için, bu 10-kat seri dilüsyonları kullanılarak ağır kirlenmiş örneklerin aşı yapmak için yararlıdır.

Bununla birlikte, bu teknikler sınırlamaları vardır. Nedeniyle, tek bir amoebal türünün kullanımına, amoebal kokültürü rezervuar olarak bir amoebal tür kullanımı bakterilerin izolasyonu izin vermeyebilir. Ayrıca, bu tür özel amoebal türler E. çoğalırlar mümkün olabilir coli çimenler ve amoebal zenginleştirme tarafından kaçırılmış olabilir. Incelenen bakteri veya amip özelliklerine bağlı olarak, amipler (Enterobacter doacae ve bazı Pseudomonas suşları iyi alternatiflerdir) beslemek için farklı bir ortam, farklı amoebal türleri ve farklı bakteri türleri test etmek için gerekli olabilir. Amoebal kokültür için kullanılan amip veya ortam bakteriyel kontaminasyon oluşabilir ve yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Bir negatif kontrol gibi yanlış pozitif sonuçlar önlemek için böylece zorunludur.

content "> Sonuç olarak, amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme serbest yaşayan amip ve amip dirençli bakteri ekolojisi ve biyolojik çeşitliliğin belirtmek için ilginç araçları temsil iki tamamlayıcı yaklaşımlar vardır. Bu teknikler, amip gibi, birçok yeni türün keşfini izin bakteri ve virüsler devi, bu yeni mikroorganizmaların patojenikliğinin araştırmak için gelecekteki çalışmalar için temel oluşturur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Acknowledgments

Biz Pr teşekkür ederim. Yardımcı teknik tavsiye ve amoebal kokültürü ve amoebal zenginleştirme üzerine ilginç bir tartışma için Bernard La Scola. Biz de bizim laboratuvarda tekniği uygulayarak yaptığı yardım için Dr Vincent Thomas teşekkür ederim.

Materials

Sınıf Türler örnekler Referans
α-Proteobacteria Odyssella thelassonicensis 10
b-Proteobacteria Burkholderia cepacia'nın 36
g-Proteobacteria Legionella drancourtii 26
Chlamydiae Estrella lausannensis 30
Flavobacteriae Amoebophilus asiaticus 37
Actinobacteria'lar Mikobakteri spp. 38
Name Company Catalog Number Comments
Glucose monohydrate Merck, Darmstadt, Germany 108342
0.22 μm pore size membrane Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCVPU11RE
proteose peptone Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 211693
yeast extract Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 212750
Cell culture flasks Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ 353135
Kova slide Hycor, Indianapolis, IN 87144
cell culture microplates Corning Inc, Corning, NY 3524
Diff-Quik staining kit Siemens Healthcare diagn., Munich, Germany 130832
Ziehl fuchsin Fluka, St-Louis, MI 21820
basic fuchsin Sigma, St-Louis, MI 857843
Phenol Sigma, St-Louis, MI P1037 Corrosive and mutagenic
malachite green oxalate Fluka, St-Louis, MI 63160
Paraformaldehyde 16% solution Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA 15710
Saponin Sigma, St-Louis, MI 84510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fraser, D. W., et al. Legionnaires' disease: description of an epidemic of pneumonia. New Engl. J. Med. 297, 1189-1197 (1977).
  2. McDade, J. E., et al. Legionnaires' disease: isolation of a bacterium and demonstration of its role in other respiratory disease. New Engl. J. Med. 297, 1197-1203 (1977).
  3. Rowbotham, T. J. Preliminary report on the pathogenicity of Legionella pneumophila for freshwater and soil amoebae. J. Clin. Pathol. 33, 1179-1183 (1980).
  4. Rodriguez-Zaragoza, S. Ecology of free-living amoebae. Crit. Rev. Microbiol. 20, 225-241 (1994).
  5. Booton, G. C., Visvesvara, G. S., Byers, T. J., Kelly, D. J., Fuerst, P. A. Identification and distribution of Acanthamoeba species genotypes associated with nonkeratitis infections. J Clin. Microbiol. 43, 1689-1693 (2005).
  6. Brussow, H. Bacteria between protists and phages: from antipredation strategies to the evolution of pathogenicity. Molecular microbiology. 65, 583-589 (2007).
  7. Greub, G., Raoult, D. Microorganisms resistant to free-living amoebae. Clin. Microbiol. Rev. 17, 413-433 (2004).
  8. Thomas, V., McDonnell, G., Denyer, S. P., Maillard, J. Y. Free-living amoebae and their intracellular pathogenic microorganisms: risks for water quality. FEMS Microbiol Rev. 34, 231-259 (2010).
  9. Birtles, R. J., Rowbotham, T. J., Storey, C., Marrie, T. J., Raoult, D. Chlamydia-like obligate parasite of free-living amoebae. Lancet. 349, 925-926 (1997).
  10. Amann, R., et al. Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl. Environ. Microbiol. 63, 115-121 (1997).
  11. Birtles, R. J., et al. Candidatus Odyssella thessalonicensis' gen. nov., sp. nov., an obligate intracellular parasite of Acanthamoeba species. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 63-72 (2000).
  12. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. Criblamydia sequanensis, a new intracellular Chlamydiales isolated from Seine river water using amoebal co-culture. Environ. Microbiol. 8, 2125-2135 (2006).
  13. Pagnier, I., Raoult, D., La Scola, B. Isolation and identification of amoeba-resisting bacteria from water in human environment by using an Acanthamoeba polyphaga co-culture procedure. Environ. Microbiol. 10, 1135-1144 (2008).
  14. Thomas, V., Loret, J. F., Jousset, M., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoebae-resisting bacteria in a drinking water treatment plant. Environ. Microbiol. 10, 2728-2745 (2008).
  15. Corsaro, D., et al. Novel Chlamydiales strains isolated from a water treatment plant. Environ. Microbiol. 11, 188-200 (2009).
  16. Goy, G., Croxatto, A., Greub, G. Waddlia chondrophila enters and multiplies within human macrophages. Microbes Infect. 10, 556-562 (2008).
  17. Kebbi-Beghdadi, C., Cisse, O., Greub, G. Permissivity of Vero cells, human pneumocytes and human endometrial cells to Waddlia chondrophila. Microbes Infect. 13, 566-574 (2011).
  18. Kebbi-Beghdadi, C., Batista, C., Greub, G. Permissivity of fish cell lines to three Chlamydia-related bacteria: Waddlia chondrophila, Estrella lausannensis and Parachlamydia acanthamoebae. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 63, 339-345 (2011).
  19. Fry, N. K., Rowbotham, T. J., Saunders, N. A., Embley, T. M. Direct amplification and sequencing of the 16S ribosomal DNA of an intracellular Legionella species recovered by amoebal enrichment from the sputum of a patient with pneumonia. FEMS Microbiol. Lett. 67, 165-168 (1991).
  20. Rowbotham, T. J. Isolation of Legionella pneumophila serogroup 1 from human feces with use of amebic cocultures. Clin. Infect. Dis. 26, 502-503 (1998).
  21. Greub, G., La Scola, B., Raoult, D. Amoebae-resisting bacteria isolated from human nasal swabs by amoebal coculture. Emerging Infect. Dis. 10, 470-477 (2004).
  22. Isenberg, H. D. Clinical microbiology procedures handbook. , (1992).
  23. Gimenez, D. F. Staining Rickettsiae in Yolk-Sac Cultures. Stain Technol. 39, 135-140 (1964).
  24. Thomas, V., Herrera-Rimann, K., Blanc, D. S., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-resisting bacteria in a hospital water network. Appl. Environ. Microbiol. 72, 2428-2438 (2006).
  25. Miyamoto, H., et al. Development of a new seminested PCR method for detection of Legionella species and its application to surveillance of legionellae in hospital cooling tower water. Appl. Environ. Microbiol. 63, 2489-2494 (1997).
  26. Lienard, J., et al. Development of a new chlamydiales-specific real-time PCR and its application to respiratory clinical samples. J. Clin. Microbiol. 49, 2637-2642 (2011).
  27. Wang, Y., Ogawa, M., Fukuda, K., Miyamoto, H., Taniguchi, H. Isolation and identification of mycobacteria from soils at an illegal dumping site and landfills in Japan. Microbiol. Immunol. 50, 513-524 (2006).
  28. Corsaro, D., Pages, G. S., Catalan, V., Loret, J. F., Greub, G. Biodiversity of amoebae and amoeba-associated bacteria in water treatment plants. Int. J. Hygiene Environ. Health. 213, 158-166 (2010).
  29. La Scola, B., et al. Legionella drancourtii sp. nov., a strictly intracellular amoebal pathogen. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54, 699-703 (2004).
  30. Thomas, V., Casson, N., Greub, G. New Afipia and Bosea strains isolated from various water sources by amoebal co-culture. Syst. Appl. Microbiol. 30, 572-579 (2007).
  31. La Scola, B., et al. Amoeba-resisting bacteria and ventilator-associated pneumonia. Emerging Infect. Dis. 9, 815-821 (2003).
  32. Collingro, A., et al. Recovery of an environmental Chlamydia strain from activated sludge by co-cultivation with Acanthamoeba sp. Microbiology. 151, 301-309 (2005).
  33. Lienard, J., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Estrella lausannensis, a new star in the Chlamydiales order. Microbes Infect. 13, 1232-1241 (2011).
  34. La Scola, B., et al. A giant virus in amoebae. Science. 299, 2033 (2003).
  35. Boyer, M., et al. Giant Marseillevirus highlights the role of amoebae as a melting pot in emergence of chimeric microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 21848-21853 (2009).
  36. Thomas, V., et al. Lausannevirus, a giant amoebal virus encoding histone doublets. Environ. Microbiol. 13, 1454-1466 (2011).
  37. Raoult, D., Renesto, P., Brouqui, P. Laboratory infection of a technician by mimivirus. Ann. Internal Med. 144, 702-703 (2006).
  38. Greub, G. Parachlamydia acanthamoebae, an emerging agent of pneumonia. Clin. Microbiol. Infect. 15, 18-28 (2009).
  39. Lamoth, F., Greub, G. Amoebal pathogens as emerging causal agents of pneumonia. FEMS Microbiol. Rev. 34, 260-280 (2010).
  40. Lienard, J. G. Ch. 6. Environmental microbiology, current technology and water applications. Ashbolt, K., Sen, N. J. , Caister Academic Press. 143-162 (2011).
  41. Boughalmi, M., et al. High-throughput isolation of giant viruses of the Mimiviridae and Marseilleviridae families in the Tunisian environment. Environ. Microbiol. , (2012).
  42. Ovrutsky, A. R., et al. Cooccurrence of Free-Living Amoebae and Nontuberculous Mycobacteria in Hospital Water Networks, and Preferential Growth of Mycobacterium avium in Acanthamoeba lenticulata. Appl. Environ. Microbiol. 79, 3185-3192 (2013).

Tags

İmmünoloji Sayı 80 Çevre Mikrobiyoloji Toprak Mikrobiyoloji Su Mikrobiyoloji Amip mikroorganizmalar kokültürü hücre içi bakteri zorunlu
Amoebal kokültürü ve Amoebal Zenginleştirme Yaklaşımlar New hücre içi patojenlerin keşif
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., … More

Jacquier, N., Aeby, S., Lienard, J., Greub, G. Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches. J. Vis. Exp. (80), e51055, doi:10.3791/51055 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter