신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성
Summary
심장 질환의 세포 기준으로 현재의 지식은 주로 동물 모델에 대한 연구에 의존한다. 여기에서 우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 하나의 실행 가능한 심근을 얻기 위해 새로운 방법을 확인합니다. 인간 심실 근세포은 전기 생리학 연구와 약물 검사를 위해 사용될 수있다.
Abstract
병에 걸린 심장에서 심근 세포는 세포 구조의 변화, 여진 수축 결합 및 막 이온 전류를 포함하는 복잡한 리모델링 과정을 실시한다. 이러한 변화는 증가 부정맥 위험과 심장병 환자의 수축기 및 이완기 기능 장애로 이어지는 수축 변경에 대한 책임을 져야 할 가능성이있다. 그러나, 심장 질환에서 심근 기능의 변화에 대한 대부분의 정보는 동물 모델에서왔다.
여기에 우리가 설명하고 심장 수술 작업을받은 환자에서 심실의 심근의 작은 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리 할 수있는 프로토콜을 확인합니다. 프로토콜 상세하게 설명한다. 전기 생리학 및 세포 내 칼슘 측정이 방법으로 얻은 인간의 심실의 심근에서 단일 세포 측정의 숫자의 타당성을 입증하는 것으로보고있다.
이 프로토콜은 그에게보고다시 다른 심장 질환의 존재에서 인간의 마음의 기능 변경의 세포 및 분자 단위의 미래 연구에 유용 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 세포 수준에서 새로운 치료 표적을 식별하고 직접 병진 값으로, 인간의 심장 근세포에서 신규 화합물의 효과를 시험하는데 사용될 수있다.
Introduction
심근의 전기 생리학 속성의 해부는 하나의 심장 근육 세포의 분리를위한 기술의 개발 이후에 현저하게 진행되고있다. 심장 흥분 수축 커플 링 (EC-커플 링)의 이해의 최근 발전은 그대로 조직의 모든 생리 학적 특성을 보유 가능한 단일 심근를 분리하는 능력에 의해 가능하게되었다. 패치 클램프 방법은 일상적 sarcolemmal 심장 이온 전류의 함수 및 약리학 적 변조를 연구하기 위해 사용된다. 칼슘 2 +에 민감한 염료와 세포 내 칼슘 역학의 녹음은 정기적으로 EC-커플 링의 생리에뿐만 아니라 내 Ca 2 +의 병리학 적 변화에 중요한 데이터를 제공하고, 건강하고 병에 걸린 다양한 모델에서 하나의 심장 근육 세포에서 수행됩니다 기계적 손상과 심장 질환의 증가 부정맥 부담으로 이어지는 항상성. 인포이 연구에서 기 임상 설정에서 약물의 전기 생리학 및 기계적 효과를 이해하는 데 매우 중요합니다. 그러나, 횡단 전류와 심장 활동 전위와 심장 역학의 특정 기능을 설명 EC-커플 링 단백질의 종 특정 차이가 있습니다. 비 인간의 포유 동물에서 분리 된 심근 세포의 연구는 생물 물리학 적 특성과 특정 횡단 이온 채널과 EC-결합 단백질의 생리 학적 역할을 밝혀 반면 따라서, 그들은 반드시 인간의 심장 근육 세포의 관련 모델을 제공하지 않습니다. 인간의 심근에서 실행 가능한 심근 세포의 분리는 완전히 심장 질환의 병태 생리를 이해하고 새로운 치료 방법을 확인하는 것이 필수적이다.
심방 부속기는 종종 수술 과정에서 폐기 될 때 인간의 심방 조직을 쉽게 사용할 수 있습니다. 성인의 심장 활동 전위와 이온 CU의 초기 양적 연구rrents는 효소 고립 심방 세포 1-4을 채택했다. 활동 전위 또는 격리 된 성인의 심실 세포에서 전류의 기록은 이후 3,5-10을보고되었습니다. 이러한 연구의 대부분은 외식 마음에서 얻은 고립 된 세포를 얻기 위해 콜라하는 관상 동맥 세그먼트 또는 절제된 조직의 상대적으로 많은 양의 노출의 콜라게나 제 관류 중 하나를 활용 한 세포를 사용했습니다. 이러한 연구는 건강한 마음에서 인간의 심실의 심근에서 터미널 심부전 환자에서 횡단 이온 전류의 수의 상세한 특성을 허용했다. L 형의 기록은 칼슘 2 + 전류 (I CA-L) 5-7, 일시적인 외부 칼륨 전류 (I가) 8, 정류기의 칼륨 내향 전류 (I가 κ1) 8, 지연 정류기의 칼륨 전류의 다른 구성 요소는 (나는 κ ) 9가보고되었습니다. 발전 및 정제분리 절차 (10)는, 활동 전위 연장 (11)를 포함하는 단말기 심장 마비의 증가 부정맥 가능성의 이온 기준의 명확한 특성을 허용 depolarizations 12 후 지연 및 이완기 탈분극과 조기 박동을 선도 재미 현재 13 증가.
성인 심장 근육 세포는 일반적으로 다양한 효소 혼합물과 온 마음, 칼슘 2 + 허용 전지 (14)의 높은 수율을 생산하는 기술의 역 행성 관류 작은 동물에서 격리됩니다. 조직의 파편에서 심장 근육 세포의 분리는 아마 때문에 관상 동맥의 관류에 의해 달성과 비교하여 각각의 근육 세포에 효소의 제한된 액세스의 본질적으로 덜 성공합니다. 인해 미사용 도너 하트 매우 제한된 가용성, 정기적으로 통상의 인간 심실 세포를 얻는 유일한 실용적인 방법은 효소 digestio입니다선택적 수술 중에 절제 종종 매우 작은 조직 조각의 명. 철저하게 세포 수준에서 특징으로 한 인간 질병 모델은 이식 마음에 접근성으로 인해 터미널 심장 마비입니다. 그러나 터미널 심장 마비 환자의 소수에서 발생하고 종종 근본적인 원인 (15)의 상대적으로 독립적 인 심근 세포의 심한 개조의 일반적인 경로를 포함한다. 질병의 초기 단계에서 비 실패한 환자에서 단일 심장 근세포의 기능을 평가하는 능력은 다른 상속 또는 취득 조건의 구체적인 기전을 이해하는 것이 중요하다. 비후성 심근증 (HCM)는 말하고 예입니다. HCM은 일반 (1 / 500 개인) 심장 비대 특징으로 상속 심장 조건으로 인해 유출로 협착 및 이완기 기능 장애 16 부정맥 위험과 수축 변경을 증가합니다. HCM의 마음에서 심근 U셀 구조의 변화 (비대, 근원 섬유 혼란)과 EC-커플 링 (17)을 포함하는 복잡한 리모델링 프로세스를 ndergo. 그러나, HCM의 심장 세포 기능 장애의 대부분의 정보는 형질 전환 동물 모델에서왔다. HCM 환자의 소수에 불과 터미널 심부전으로 발전과 심장 이식을 필요로하기 때문에, HCM 마음은 표준 방법과 세포의 분리에 매우 드물게 사용할 수 있습니다. 그러나, HCM 환자의 30 % 이상은 수축기 (HCM) 18시 대규모 중격 비대 바꾸는 유출 요로 혈액의 흐름에 의한 폐색 증상을 개발할 수 있습니다. HCM에 방해의 기복을위한 가장 효과적인 가능한 치료 옵션은 수술 중격 절제술입니다 :이 수술하는 동안, 상단 격막의 변수 크기의 부분은 트랜스 대동맥 접근 방식에 의해 제거된다. 비대 격막의이 부분은 신선한 조직에서 세포 분리를위한 따라서 사용할 수 있습니다.
인간 ventricula의 분리를위한 방법R 하나의 작은 경정맥 심 내막 심근 생검 조직에서 근육 세포는 이전에 개발 된 19를 발표하고있다. 우리는 중격 절제술 및 밸브 교체 절차를받은 환자를받은 HCM 환자를 포함하여 심장 수술을받은 환자에서 심실의 심근 샘플에서 단일 중격 근육 세포를 분리하는 방법을 구현했습니다. 분리 프로토콜, 대표적인 전기 생리학 및 CA 2 + 형광에 대한 자세한 설명뿐만 아니라 측정은 고립 된 인간의 심실의 심근 세포의 생존 및 패치 클램프 및 세포 내 칼슘 2 + 연구의 가능성을 보여되게됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 기술과 인간의 심실의 심근의 수술 샘플에서 실행 가능한 심근 세포를 분리하는 방법을 확인했다. 성공적으로 병에 걸린 심실의 심근에서 하나의 실행 가능한 심근 세포의 분리가 개발 및 미세 조정 된 수 있도록 심방 외과 샘플, 기술에서 고립 된 세포에 사용되었던 이전에 설명한 프로토콜에서 시작. 초기 보고서는 선택적으로, 생리 학적 자극 8,24에 변경된 전기 생리학 특성 및 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 EU (STREP 프로젝트 241577 "큰 마음,"제 7 회 유럽 프레임 워크 프로그램, CP), MENARINI 국제 운영 룩셈부르크 (AM), 텔레 톤 GGP07133 (CP)과 길르앗 과학 (AM)에 의해 지원되었다.
Materials
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
| Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
| 3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
| Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
| Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
| Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
| Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
| Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
| FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
| Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
| Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
| Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
| Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
| Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
| pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
| Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested |
| Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
| Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods |
Referências
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