Современные знания на клеточном основе сердечных заболеваний в основном опирается на исследования на моделях животных. Здесь мы опишем и проверить новый метод для получения одного жизнеспособного кардиомиоциты от небольших хирургических образцах миокарда человека желудочка. Миоциты человека желудочковая могут быть использованы для электрофизиологических исследований и тестирования на наркотики.
Кардиомиоциты от больных сердец подвергаются сложных ремоделирования процессов, связанных с изменениями в структуре клеток, сокращение возбуждения муфты и мембраны ионных токов. Эти изменения, вероятно, будут ответственны за увеличение аритмогенного риска и сократительных изменений, ведущих к систолического и диастолического дисфункции у кардиологических больных. Тем не менее, большая часть информации об изменениях функции миоцитов при кардиологических заболеваниях пришел из животных моделей.
Здесь мы опишем и проверить протокол для изоляции жизнеспособных миоцитов от небольших хирургических образцах миокарда желудочков у пациентов, перенесших операции на сердце операции. Протокол описан подробно. Электрофизиологические и внутриклеточных измерений кальция, как сообщается, продемонстрировать возможность ряда измерений одиночных клеток в кардиомиоциты желудочков человека, полученных с помощью этого метода.
Протокол сообщил онповторно может быть полезно для будущих исследований в области клеточной и молекулярной основе функциональных изменений человеческого сердца в присутствии различных сердечных заболеваний. Кроме того, этот метод может быть использован для идентификации новых терапевтических целей на клеточном уровне и для проверки эффективности новых соединений на кардиомиоцитов человека, с прямым поступательного стоимости.
Рассечение электрофизиологических свойств миокарда прогрессировала заметно после разработки методов для одной изоляции сердечной миоцитов. Последние достижения в понимании сердечной возбуждения сжимающих Муфта (ИС-связь) также стало возможным благодаря способности изоляции жизнеспособных одиночных кардиомиоцитов, которые сохраняют все физиологические свойства неповрежденной ткани. Регулярно используются методы патч зажим для изучения функции и фармакологической модуляции сердечного сарколемных ионных токов. Записи динамики внутриклеточного кальция с Са 2 + чувствительных красителей также регулярно выступал на отдельных кардиомиоцитов из различных здоровых и больных моделей, предоставляя жизненно важные данные о физиологии EC-муфтой, а также на патологических изменений внутриклеточного Ca 2 + гомеостаз приводит к механической обесценение и повышенной аритмогенного бремени при кардиологических заболеваниях. InformaТион из этих исследований имеет решающее значение для понимания электрофизиологические и механические эффекты препаратов в клинических условиях. Однако есть виды характерные отличия в трансмембранных токов и в белках EC-Голова, на которые приходится особенностей потенциала сердечной действий и сердечных механики. Таким образом, в то время как исследования миоцитов изолированных от не человека млекопитающих выяснена биофизические свойства и физиологические роли конкретных трансмембранных ионных каналов и EC-Голова белков, они не обязательно предоставлять соответствующие модели кардиомиоцитов человека. Выделение жизнеспособных миоцитов из миокарда человека Поэтому крайне важно, чтобы в полной мере понять патофизиологии заболеваний сердца и утвердить новые терапевтические подходы.
Человеком предсердий ткань легко доступна как ушек предсердий часто отбрасывается во время хирургических процедур. Первоначальные количественные исследования взрослого человека потенциалов сердца действий и ионной у.е.rrents занятых ферментативно изолированный: мерцательная ячеек 1-4. Записи потенциалов действия или токов от отдельных взрослых желудочковой клеток человека были впоследствии сообщил 3,5-10. Большинство из этих исследований использовали клетки, полученные из эксплантированных сердца и используемые либо коллагеназы перфузии сегмента коронарной артерии или воздействием относительно большого количества вырезанной ткани коллагеназы, чтобы получить изолированных клеток. Эти исследования позволили подробную характеристику ряда трансмембранных ионных токов от желудочковой кардиомиоцитов человека от здоровых сердец и от пациентов с терминальной сердечной недостаточности. Записи L-типа Са 2 + ток (Я Ca-L) 5-7, переходный ток наружу калия (я к) 8, внутрь выпрямителя тока калия (Я κ1) 8, различные компоненты замедленного выпрямителя тока калия (Я κ ) 9 поступало. Авансы и переработкапроцедура изоляции 10, позволило четко охарактеризовать ионной основе возросшей аритмогенного потенциала в терминальной сердечной недостаточности, содержащей потенциала действия продление 11, задержка после деполяризаций 12 и увеличился смешное текущий 13 приводит к диастолической деполяризации и экстрасистол.
Взрослые кардиомиоцитов, как правило, изолированы от мелких животных по ретроградной перфузии всем сердцем с различными смесей ферментов, техника, которая производит высокие урожаи Ca 2 +-толерантных клеток 14. Выделение кардиомиоцитов из фрагментов ткани по своей сути менее успешным, вероятно, из-за ограниченного доступа ферментов в отдельных миоцитов по сравнению с, что достигается за счет перфузии коронарных артерий. Из-за очень ограниченного наличия неиспользованных доноров сердца, единственный практический способ получить нормальные человеческие желудочков клетки на регулярной основе является путем ферментативного digestioн из часто очень небольших фрагментов ткани, вырезанных во время плановых хирургических процедур. Единственная модель болезни человека, который был тщательно характеризуется на клеточном уровне является терминал сердечная недостаточность, из-за доступности пересаженных сердец. Тем не менее, терминал сердечная недостаточность возникает в меньшинстве пациентов и часто включает в себя общий путь тяжелой ремоделирования клеток миокарда, которая является относительно независимым от основной причины 15. Возможность оценить функцию отдельных кардиомиоцитов из пациентов на более ранней, не сбой стадии заболевания важно понять конкретную патофизиологии различных наследственных или приобретенных условиях. Гипертрофическая кардиомиопатия (HCM) является показательным примером. НСМ является общим (1/500 человек) по наследству сердечной состояние, характеризующееся гипертрофии сердца, повышенное аритмогенных риска и сократительные изменений вследствие обструкции выходного тракта и диастолической дисфункции 16. Кардиомиоцитов из HCM сердцах уndergo достаточно сложные ремоделирования процессы с участием изменения в структуре клеток (гипертрофия, миофибриллярный беспорядок) и EC-муфта 17. Тем не менее, большая часть информации из миоцитов дисфункции у HCM пришел из трансгенных животных моделях. Поскольку только меньшинство пациентов HCM развивается в сторону терминальной сердечной недостаточности и требует трансплантации сердца, HCM сердца очень редко доступны для выделения клеток со стандартными методами. Тем не менее, по крайней мере, 30% пациентов HCM развивать симптомы обструкции из-за массивного притока крови гипертрофия перегородки изменяющие выносящего тракта во время систолы (HCM) 18. Наиболее эффективным доступны терапевтический вариант для облегчения обструкции в HCM является хирургическое перегородки myectomy: во время этой хирургической процедуры, переменная размера часть верхней перегородки удаляют транс аорты подхода. Эта часть гипертрофированной перегородки Поэтому для выделения клеток из свежей ткани.
Способ выделения человеческого ventriculaг миоциты с одного, малых трансвенозной эндомиокардиальной биопсии был ранее разработан и опубликован 19. Мы реализовали метод, чтобы изолировать одиночные септальные миоциты из образцов миокарда желудочков у пациентов, перенесших операцию на сердце, в том числе пациентов с HCM, проходящих перегородки myectomy и пациентов, перенесших процедуры замены клапана. В дополнение к подробным описанием протокола изоляции, представитель электрофизиологических и Са 2 + флуоресценции измерения представлены, демонстрируя жизнеспособность изолированных желудочковых миоцитов человека и возможности патч зажима и внутриклеточных Са 2 + исследований.
Мы описали и утверждена метод, чтобы изолировать жизнеспособные миоциты от хирургических образцах миокарда человека желудочка. Начиная с описанными ранее протоколов, которые были успешно использованы для изолированных клеток от предсердий хирургических образцов, техники, чтобы поз?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана ЕС (STREP проекта 241577 "Большое сердце", 7-й Европейской рамочной программы, CP), Menarini международных операций Люксембурге (AM), Телемарафон GGP07133 (СР) и Gilead Sciences (AM).
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested |
Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods |