Aislamiento y caracterización funcional de Human ventricular cardiomiocitos a partir de muestras quirúrgicas recientes

Summary

Los conocimientos actuales sobre las bases celulares de las enfermedades cardiacas se basa principalmente en estudios sobre modelos animales. Aquí describimos y validar un nuevo método para obtener cardiomiocitos viables individuales de pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. Miocitos ventriculares humanos pueden ser utilizados para estudios electrofisiológicos y las pruebas de drogas.

Abstract

Los cardiomiocitos de corazones enfermos son sometidos a procesos de remodelación de complejos que implican cambios en la estructura celular, contracción de acoplamiento excitación y corrientes iónicas de membrana. Esos cambios son probable que sea responsable del aumento del riesgo arritmogénica y las alteraciones contráctiles conducen a la disfunción sistólica y diastólica en pacientes cardíacos. Sin embargo, más información sobre las alteraciones de la función de los miocitos en enfermedades cardíacas ha llegado a partir de modelos animales.

Aquí describimos y validar un protocolo para aislar miocitos viables desde pequeñas muestras quirúrgicas de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a operaciones de cirugía cardiaca. El protocolo se describe en detalle. Mediciones electrofisiológicas y de calcio intracelulares se presentan para demostrar la viabilidad de un número de mediciones de células individuales en cardiomiocitos ventriculares humanos obtenidos con este método.

El protocolo informó élre pueden ser útiles para futuras investigaciones sobre las bases celulares y moleculares de las alteraciones funcionales del corazón humano en la presencia de diferentes enfermedades cardiacas. Además, este método puede ser usado para identificar nuevas dianas terapéuticas a nivel celular y para probar la eficacia de nuevos compuestos en cardiomiocitos humanos, con valor de traslación directa.

Introduction

La disección de las propiedades electrofisiológicas del miocardio ha progresado notablemente después el desarrollo de técnicas para el solo aislamiento de miocitos cardiacos. También se han hecho posible los avances recientes en la comprensión de la excitación cardíaca contracción de acoplamiento (EC-Acoplamiento) por la capacidad de aislar los cardiomiocitos viables individuales que conservan todas las propiedades fisiológicas del tejido intacto. Métodos de fijación Patch se emplean rutinariamente para estudiar la función y la modulación farmacológica de las corrientes de iones sarcolema cardíaco. Grabaciones de la dinámica del calcio intracelular con Ca ^{2 +} tintes sensibles también se llevan a cabo regularmente en los miocitos cardíacos individuales de una variedad de modelos sanos y enfermos, proporcionar datos vitales sobre la fisiología de la CE-acoplamiento, así como en las alteraciones patológicas de la intracelular de Ca ^{2 +} homeostasis que conlleva un deterioro mecánico y aumento de la carga de las enfermedades cardíacas arritmogénica. Información de estos estudios es fundamental para la comprensión de los efectos mecánicos y electrofisiológicos de las drogas en el ámbito clínico. Sin embargo, hay diferencias entre especies específicas en las corrientes transmembrana y en las proteínas CE-acoplamiento que dan cuenta de las características específicas de potencial de acción cardíaco y la mecánica cardíaca. Por lo tanto, mientras que los estudios de miocitos aislados de mamíferos no humanos han dilucidado las propiedades biofísicas y funciones fisiológicas de los canales iónicos transmembrana específicos y proteínas CE-acoplamiento, que no proporcionan necesariamente modelos pertinentes de miocitos cardiacos humanos. Por lo tanto, el aislamiento de miocitos viables de miocardio humano es esencial para entender completamente la fisiopatología de las enfermedades cardíacas y validar nuevos enfoques terapéuticos.

Tejido auricular humano es fácilmente disponible como apéndices auriculares son a menudo descartados durante los procedimientos quirúrgicos. Estudios cuantitativos iniciales de los potenciales de acción cardiaco humanos adultos y cu iónicarrents emplean células auriculares enzimáticamente aislados ^1-4. Las grabaciones de los potenciales o corrientes a partir de células humanas adultas ventriculares aislados de acción han sido posteriormente reportado ^3,5-10. La mayoría de estos estudios se han utilizado células obtenidas de corazones explantados y utilizados ya sea colagenasa de perfusión de un segmento de la arteria coronaria o la exposición de cantidades relativamente grandes de tejido extirpado a la colagenasa para obtener células aisladas. Estos estudios permiten una caracterización detallada de un número de corrientes de iones transmembrana de los cardiomiocitos ventriculares humanos de corazones sanos y de pacientes con insuficiencia cardiaca terminal. Grabaciones de L-tipo Ca ^{2 +} actual (I _Ca-L) ^5-7, corriente hacia el exterior de potasio transitoria _(I) ^8, la corriente de entrada del rectificador de potasio (I _κ1) ^8, los diferentes componentes de la corriente de potasio rectificadora retardada (I _κ ) ⁹ han sido reportados. Avances y refinación deel procedimiento de aislamiento ^10, permite una caracterización clara de la base iónica del aumento del potencial arritmogénica en la insuficiencia cardíaca terminal, que comprende la acción potencial de prolongación ^11, retrasó después de despolarizaciones ¹² y aumentó divertido corriente ¹³ que conduce a la despolarización diastólica y latidos prematuros.

Miocitos cardíacos adultos normalmente están aislados de animales pequeños por perfusión retrógrada de todo el corazón con diferentes mezclas de enzimas, una técnica que produce altos rendimientos de Ca ^{2 +-células} tolerantes ^14. Aislamiento de miocitos cardiacos a partir de fragmentos de tejido es inherentemente menos éxito probablemente a causa de la limitación del acceso de las enzimas a miocitos individuales en comparación con la alcanzada por la perfusión de las arterias coronarias. Debido a la limitada disponibilidad de los corazones de donantes no utilizadas, la única forma práctica de obtener células ventriculares humanos normales sobre una base regular es por digestio enzimátican de los fragmentos muy pequeños a menudo tejidos extirpados durante los procedimientos quirúrgicos electivos. El único modelo de enfermedad humana que se ha caracterizado a fondo a nivel celular es la insuficiencia cardíaca terminal, debido a la accesibilidad a los corazones trasplantados. Sin embargo, la insuficiencia cardíaca terminal se produce en una minoría de los pacientes y a menudo implica una vía común de la remodelación severa de las células del miocardio, que es relativamente independiente de la causa subyacente ^15. La capacidad de evaluar la función de los cardiomiocitos individuales de los pacientes en una etapa anterior no no de la enfermedad es crucial para entender la patofisiología específica de diferentes enfermedades hereditarias o adquiridas. La miocardiopatía hipertrófica (MCH) es un ejemplo elocuente. HCM es un frecuente (1/500 personas) condición cardiaca hereditaria caracterizada por hipertrofia cardiaca, aumento de alteraciones de riesgo y contráctiles arritmogénicas debido a la obstrucción del tracto de salida y la disfunción diastólica ^16. Los cardiomiocitos de corazones HCM undergo unos complejos procesos de remodelación que implican cambios en la estructura celular (hipertrofia, desorganización miofibrilar) y CE-Acoplamiento ^17. Sin embargo, la mayoría de la información de la disfunción de los miocitos en HCM ha venido de modelos animales transgénicos. Dado que sólo una minoría de pacientes con MCH evoluciona hacia la insuficiencia cardíaca terminal y requiere de un trasplante cardíaco, el corazón de HCM son muy rara vez están disponibles para el aislamiento de células con los métodos estándar. Sin embargo, al menos el 30% de los pacientes con MCH presentan síntomas obstructivos debido al flujo de sangre del tracto de salida alteración hipertrofia septal masiva durante la sístole (HCM) ^18. La opción terapéutica disponible más eficaz para el alivio de la obstrucción en la MCH es la miectomía septal quirúrgica: durante este procedimiento quirúrgico, una porción de tamaño variable del tabique superior se elimina por vía aórtica trans. Esta porción de tabique hipertrofiado es, por tanto, disponible para el aislamiento de células del tejido fresco.

Un método para el aislamiento de ventricula humanar miocitos de pequeñas muestras endomiocárdicas individuales, transvenosos biopsia se ha desarrollado y publicado previamente ^19. Hemos implementado un método para aislar miocitos septales individuales de las muestras de miocardio ventricular de los pacientes sometidos a cirugía cardíaca, incluyendo pacientes con HCM sometidos miectomía septal y los pacientes sometidos a procedimientos de reemplazo de válvulas. Además de una descripción detallada del protocolo de aislamiento, electrofisiológicos representativa y Ca ^{2 +} fluorescencia se presentan las mediciones, lo que demuestra la viabilidad de los miocitos ventriculares aislados humanos y la viabilidad de patch clamp e intracelulares de Ca ^{2 +} Estudios.

Protocol

Los protocolos experimentales sobre el tejido humano fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad de Careggi Hospital (2006/0024713; renovada mayo de 2009). Cada paciente dio su consentimiento informado por escrito. 1. Soluciones y Preparación del equipo Las soluciones se describen en la Tabla 1. Un diagrama de flujo simplificado del procedimiento de aislamiento de células se encuentra en la Figura 1. <table bo…

Representative Results

Se empleó el método descrito anteriormente para caracterizar las anormalidades funcionales de cardiomiocitos aislados del tabique interventricular de pacientes con miocardiopatía hipertrófica (MCH) que se sometieron a la operación miectomía, en comparación con los pacientes no quirúrgicos que fallan no hipertróficas 21. Los resultados que figuran en esta sección se derivan de que el trabajo 21 y se muestra aquí como un ejemplo de cómo esta técnica se puede utilizar para caracterizar la…

Discussion

Hemos descrito y validado un método para aislar miocitos viables a partir de muestras quirúrgicas de miocardio ventricular humano. A partir de los protocolos descritos anteriormente que había sido utilizado con éxito para células aisladas a partir de muestras quirúrgicas auriculares, la técnica para permitir la separación de los miocitos viables individuales de miocardio ventricular enferma fue desarrollado y afinado. Los primeros informes mostraron que el aislamiento de los cardiomiocitos individuales de trozos…

Materials

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)	Sigma-Aldrich	P9791
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O)	Sigma-Aldrich	M1880
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Adenosine	Sigma-Aldrich	A9251
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Mannitol	Sigma-Aldrich	M4125
Taurine	Sigma-Aldrich	T0625
Potassium hydroxide (KOH)	Sigma-Aldrich	P5958
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653
Potassium chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9333
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S7907
Sodium bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S6297
Potassium bicarbonate (KHCO3)	Sigma-Aldrich	237205
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P2256
2,3-Butanedione monoxime	Sigma-Aldrich	B0753
Sodium hydroxide(NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate	Sigma-Aldrich	49601
Pyruvic acid	Sigma-Aldrich	107360
3-Hydroxybutyric acid	Sigma-Aldrich	166898
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP)	Sigma-Aldrich	A8937
Creatine	Sigma-Aldrich	C0780
Succinic Acid	Sigma-Aldrich	S3674
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E0396
Albumin from bovine serum	Sigma-Aldrich	A0281
Magnesium chloride (MgCl2)	Sigma-Aldrich	M8266
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V	Sigma-Aldrich	C9263
Proteinase, Bacterial, Type XXIV	Sigma-Aldrich	P8038
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O	Sigma-Aldrich	21115
Calcium chloride 0.1 M solution	Sigma-Aldrich	53704
Potassium methanesulfonate	Sigma-Aldrich	83000
FluoForte Reagent	Enzo Life Sciences	ENZ-52015
Powerload concentrate, 100X	Life Technologies	P10020
Perfusion Fast-Step System	Warner Instruments	VC-77SP
Amphotericin B solubilized	Sigma-Aldrich	A9528
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier	Molecular Devices
Digidata 1440A	Molecular Devices
pClamp10.0	Molecular Devices
Digestion Device	CUSTOM	CUSTOM	The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested
Silicone elastomer for the digestion device's brushes	Dow Corning	SYLGARD® 184
Variable speed rotating motor for the digestion device	Crouzet	Crouzet 178-4765
Mold for brushes casting	N.A.	N.A.	The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods