Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.
Hartspiercellen van zieke harten zijn onderworpen aan complexe verbouwing processen waarbij veranderingen in de celstructuur, excitatie contractie koppeling en membraan ion stromingen. Deze veranderingen zijn waarschijnlijk verantwoordelijk voor het verhoogde risico aritmogene en contractiele wijzigingen waardoor systolische en diastolische disfunctie bij hartpatiënten zijn. Echter, de meeste informatie over de wijzigingen van myocyte functie in hartziekten is afkomstig van diermodellen.
Hier beschrijven we en valideren van een protocol om levensvatbare myocytes isoleren van kleine chirurgische monsters van ventriculaire myocardium van patiënten die een hartoperatie operaties. Het protocol wordt beschreven. Elektrofysiologische en intracellulair calcium metingen worden gerapporteerd aan de haalbaarheid van een enkele cel metingen in humane ventriculaire cardiomyocyten verkregen met deze werkwijze tonen.
Het protocol meldde hijre kan nuttig zijn voor toekomstige onderzoeken van de cellulaire en moleculaire basis van functionele veranderingen van het menselijke hart in de aanwezigheid van verschillende hartziekten zijn. Verder kan deze methode worden gebruikt om nieuwe therapeutische targets op cellulair niveau te identificeren en de effectiviteit van nieuwe verbindingen te testen op menselijke cardiomyocyten, directe translationele waarde.
Dissectie van de elektrofysiologische eigenschappen van het myocard heeft na de ontwikkeling van technieken voor enkele hartspiercel isolatie aanzienlijk gevorderd. Recente ontwikkelingen in het begrijpen van cardiale Excitatie contractiekoppeling (EG-koppeling) zijn ook mogelijk gemaakt door het vermogen isoleren levensvatbare enkele cardiomyocyten dat alle fysiologische eigenschappen van het intacte weefsel behouden. Patch clamp methoden worden routinematig gebruikt om de functie en farmacologische modulatie van cardiale sarcolemmale ionstromen bestuderen. Opnamen van intracellulair calcium dynamiek Ca2 + gevoelige kleurstoffen worden regelmatig uitgevoerd in enige cardiale myocyten uit verschillende gezonde en zieke modellen, waarbij het belangrijke gegevens over de fysiologie van EG-koppeling en op de pathologische veranderingen van intracellulaire Ca2 + homeostase leidt tot mechanische stoornissen en verhoogde aritmogeen lasten op hartziekten. Informatie van deze studies is cruciaal voor het begrijpen van de elektrofysiologische en mechanische effecten van geneesmiddelen in de klinische setting. Er zijn soortspecifieke verschillen in de transmembraan stromen en de EG-koppeling eiwitten die verantwoordelijk zijn voor specifieke kenmerken van cardiale actiepotentiaal en cardiale mechanica. Dus, terwijl studies van myocytes geïsoleerd van niet-menselijke zoogdieren de biofysische eigenschappen en fysiologische rol van specifieke transmembraan ionkanalen en EG-Koppeling eiwitten hebben opgehelderd, zij niet noodzakelijkerwijs relevante modellen van menselijke hartspiercellen. Isolatie van levensvatbare myocytes van menselijke hartspier is daarom essentieel om volledig te begrijpen van de pathofysiologie van hart-en vaatziekten en valideren van nieuwe therapeutische benaderingen.
Menselijke atriaal weefsel beschikbaar atriale aanhangsels vaak tijdens chirurgische procedures worden verwijderd. Initiële kwantitatieve studies van volwassen menselijke cardiale actiepotentialen en ionische currents werkzaam enzymatisch geïsoleerde atriale cellen 1-4. Opnames van actiepotentialen of stromen van geïsoleerde menselijke ventriculaire cellen volwassen zijn vervolgens gerapporteerd 3,5-10. De meeste van deze studies gebruikte cellen verkregen uit geëxplanteerde harten en gebruikt hetzij collagenase perfusie van een kransslagader segment of blootstelling van relatief grote hoeveelheden weggesneden weefsel collagenase geïsoleerde cellen te verkrijgen. Deze studies kon een gedetailleerde karakterisering van een aantal transmembraan ionstromen van humane ventriculaire cardiomyocyten van gezonde hart en patiënten met terminale hartfalen. Opnamen van L-type Ca2 + (I Ca-L) 5-7, voorbijgaande buitenwaartse kaliumstroom (I) 8 binnenwaartse kaliumstroom (I κ1) 8, de verschillende componenten van vertraagde gelijkrichter kalium (I κ ) 9 gemeld. Voorschotten en raffinage vande isolatie procedure 10, kon een duidelijk karakterisering van de ionische basis van de toegenomen arrhythmogenic potentieel in terminal hartfalen, bestaande uit actiepotentiaal verlenging 11, vertraagd na depolarisaties 12 en verhoogde grappige huidige 13 leidt tot diastolische depolarisatie en premature slagen.
Volwassen hartspiercellen gewoonlijk geïsoleerd uit kleine dieren door retrograde perfusie van het gehele hart met verschillende enzymmengsel een techniek die hoge opbrengsten van Ca 2 +-tolerante cellen 14 produceert. Isolatie van cardiale myocyten van fragmenten van weefsel inherent minder succesvol waarschijnlijk vanwege de beperkte toegankelijkheid van enzymen individuele myocyten vergeleken met die bereikt door perfusie van kransslagaders. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van ongebruikte donorharten, de enige praktische manier om normale humane ventriculaire cellen te verkrijgen regelmatig is door enzymatische spijn van de vaak zeer kleine weefselfragmenten weggesneden tijdens electieve chirurgische procedures. De enige menselijke ziektemodel die grondig gekarakteriseerd op celniveau terminaal hartfalen, vanwege de toegankelijkheid van getransplanteerde harten. Echter, terminal hartfalen optreedt in een minderheid van de patiënten vaak gaat om een gemeenschappelijke route van ernstige herinrichting van myocardiale cellen, die relatief onafhankelijk van de onderliggende oorzaak 15. De mogelijkheid om de functie van afzonderlijke hartspiercellen uit beoordelen patiënten eerder niet falende stadium van de ziekte is cruciaal voor de specifieke pathofysiologie van verschillende erfelijke of verworven aandoeningen begrijpen. Hypertrofische cardiomyopathie (HCM) is een sprekend voorbeeld. HCM is een gemeenschappelijke (1/500 personen) erfelijke cardiale aandoening gekenmerkt door hypertrofie van het hart, verhoogde arrhythmogenic risico en contractiele veranderingen als gevolg van obstructie van de uitstroom en diastolische dysfunctie 16. Hartspiercellen van HCM harten undergo een complexe verbouwing processen die veranderingen in celstructuur (hypertrofie, myofibrillar wanorde) en EG-Koppeling 17. Echter, de meeste informatie van myocyte disfunctie bij HCM is afkomstig van transgene diermodellen. Aangezien slechts een minderheid van de HCM patiënten evolueert in de richting van terminal hartfalen en vereist harttransplantatie, HCM harten zijn zeer zelden beschikbaar voor celisolatie met standaard methoden. Echter, ten minste 30% van de HCM patiënten ontwikkelen obstructieve symptomen als gevolg van massale septum hypertrofie veranderen uitstroombaan bloedstroom tijdens systole (HCM) 18. De meest effectieve beschikbare therapeutische optie voor de verlichting van de obstructie in HCM is chirurgische septum myectomy: tijdens deze chirurgische procedure wordt een variabele grootte deel van de bovenste septum verwijderd door trans aorta aanpak. Dit gedeelte van hypertrofe septum is dus beschikbaar voor celisolatie uit de verse weefsel.
Werkwijze voor de isolatie van menselijke ventricular myocytes van enkele, kleine transvenous endomyocardiale biopsiespecimens eerder is ontwikkeld en gepubliceerd 19. We hebben een methode om enkele septum myocytes isoleren van ventriculaire myocard monsters van patiënten die hartchirurgie ondergaan, waaronder patiënten met HCM ondergaan septum myectomy en patiënten die een klepvervanging procedures. Naast een gedetailleerde beschrijving van de isolatieprotocol representatief elektrofysiologische en Ca2 + fluorescentiemetingen worden, dat de levensvatbaarheid van de geïsoleerde humane ventriculaire myocyten en de haalbaarheid van patch clamp en intracellulaire Ca2 + onderzoeken.
Wij hebben beschreven en gevalideerde werkwijze levensvatbare myocyten isoleren van chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Vanaf eerder beschreven protocollen die met succes had gebruikt om geïsoleerde cellen van atriale chirurgische monsters, de techniek om de scheiding van enkele levensvatbare myocytes van zieke ventriculaire myocard werd ontwikkeld en verfijnd. Vroege rapporten bleek dat isolatie van enkele hartspiercellen uit brokken van atriale en ventriculaire weefsel selectief verminderde repo…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door de EU (STREP Project 241577 "GROOT HART," 7de Europese Kaderprogramma, CP), Menarini International Operations Luxembourg (AM), Telethon GGP07133 (CP) en Gilead Sciences (AM).
Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | |
Magnesium sulfate heptahydrate(MgSO4 * 7H2O) | Sigma-Aldrich | M1880 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Adenosine | Sigma-Aldrich | A9251 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | |
Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Potassium bicarbonate (KHCO3) | Sigma-Aldrich | 237205 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
Sodium hydroxide(NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045 | |
L-Glutamic acid monopotassium salt monohydrate | Sigma-Aldrich | 49601 | |
Pyruvic acid | Sigma-Aldrich | 107360 | |
3-Hydroxybutyric acid | Sigma-Aldrich | 166898 | |
Adenosine 5′-triphosphate dipotassium salt dihydrate (K2-ATP) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
Creatine | Sigma-Aldrich | C0780 | |
Succinic Acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
Albumin from bovine serum | Sigma-Aldrich | A0281 | |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type V | Sigma-Aldrich | C9263 | |
Proteinase, Bacterial, Type XXIV | Sigma-Aldrich | P8038 | |
Calcium chloride solution, ~1 M in H2O | Sigma-Aldrich | 21115 | |
Calcium chloride 0.1 M solution | Sigma-Aldrich | 53704 | |
Potassium methanesulfonate | Sigma-Aldrich | 83000 | |
FluoForte Reagent | Enzo Life Sciences | ENZ-52015 | |
Powerload concentrate, 100X | Life Technologies | P10020 | |
Perfusion Fast-Step System | Warner Instruments | VC-77SP | |
Amphotericin B solubilized | Sigma-Aldrich | A9528 | |
Multiclamp 700B patch-clamp amplifier | Molecular Devices | ||
Digidata 1440A | Molecular Devices | ||
pClamp10.0 | Molecular Devices | ||
Digestion Device | CUSTOM | CUSTOM | The device is custome made in our laboratory using plastic tubes, cast Sylgard and a motor; it is described in detail in Fig 1 C-D and in Fig.7. We can provide further details if requested |
Silicone elastomer for the digestion device's brushes | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
Variable speed rotating motor for the digestion device | Crouzet | Crouzet 178-4765 | |
Mold for brushes casting | N.A. | N.A. | The mold is custom made from standard PTFE 2.5 cm diameter rods |