Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata
Summary
Molti mRNA codificanti proteine mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.
Abstract
La maggior parte delle proteine mitocondriali sono codificati nel nucleo e devono essere importati nel organello. Import può verificarsi durante la proteina è sintetizzata nei pressi dei mitocondri. Il supporto per questa possibilità deriva da studi recenti, in cui molti mRNA codificanti proteine mitocondriali hanno dimostrato di essere localizzato nei pressi mitocondri. Insieme con dimostrazioni precedenti di associazione ribosomi 'con la membrana esterna, questi risultati suggeriscono un processo di traduzione localizzata. Tale traduzione localizzata può migliorare l'efficienza di importazione, di fornire siti di regolazione unici e ridurre al minimo i casi di espressione ectopica. Diversi metodi sono stati utilizzati per caratterizzare i fattori ed elementi che mediano traduzione localizzata. Standard tra questi è frazionamento subcellulare mediante centrifugazione differenziale. Questo protocollo ha il vantaggio di isolamento di mRNA, ribosomi e proteine in una singola procedura. Questi possono poi essere caratterizzata da diverse molecolare e biMetodi ochemical. Inoltre, trascrittomica e proteomica metodi possono essere applicati al materiale risultante, permettendo quindi intuizioni genoma di ampiezza. L'utilizzo di lievito come organismo modello per tali studi ha i vantaggi di velocità, costi e semplicità. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati e ceppi di delezione disponibili agevolare la verifica dei fattori candidati.
Introduction
Le cellule eucariotiche sono organizzate in compartimenti distinti aventi funzioni specifiche. Per realizzare la sua funzione, ciascun compartimento contiene un insieme unico di proteine che sono essenziali per la sua attività. Un possibile meccanismo attraverso il quale queste proteine si avvicinano loro scompartimento è di 1,2 traduzione localizzata. In questo processo, la proteina è sintetizzata a destinazione ribosomi e mRNA che si trovano lì. Tra i probabili vantaggi di una versione localizzata sono aumentati efficienza della proteina targeting, ridotto bisogno di accompagnatori di proteine, e consentendo meccanismi di regolazione site-specific. Inoltre, mRNA e ribosomi in lingua possono essere un serbatoio appartata di macchinari traduzione in casi di stress cellulare, quando la traduzione generale è inibita.
I mitocondri è diventato negli ultimi anni un modello centrale per lo studio di traduzione localizzata. La maggior parte delle proteine mitocondri sono codificate nel nucleo, tradotto nel citosol,e importati nel organello. Varie evidenze indicano che molte di queste proteine sono prodotte attraverso un processo di traduzione locale. Inizialmente, gli studi di microscopia elettronica e di frazionamento biochimico rilevati ribosomi associati con i mitocondri 3-5. Questi studi dove poi corroborati in vivo dal lavoro su specifici mRNA, che sono stati trovati ad essere importati solo in modo 6,7 cotranslational. Studi genoma di ampiezza di mRNA associazione con mitocondri rivelato che una frazione significativa di mRNA sono localizzate ai mitocondri vicinanze 8-10. Alcuni di questi mRNA sono stati ulteriormente caratterizzati dal vivo fluorescenza metodi, come il pesce o MTAG 9,11. Un'interpretazione straight-forward di questa associazione è che questi mRNA servono come modelli per la traduzione localizzata.
I meccanismi con cui questi mRNA avvicinano i mitocondri sono sconosciute. Domini non codificanti (più significantly 3 'UTR) hanno dimostrato di essere coinvolti in mRNA associazione ai mitocondri 12. Questi domini sono suscettibili di servire come un sito di legame di RNA-binding proteins che mediano il loro trasporto. Gli studi in lievito hanno rivelato che un membro della famiglia PUM delle proteine (Puf3) supporta mRNA associazione con mitocondri 8,13. Un ruolo plausibile per Puf3, che si basa su funzioni di altri membri della famiglia, è quello di inibire traduzione mentre il mRNA è rotta 14. Così, mRNA possono essere trasportati in uno stato nontranslated, da RNA proteine leganti che interagiscono con le regioni non codificanti. In alternativa, un grande corpo di lavoro suggerisce che il trasporto avviene mentre la proteina viene sintetizzata. In particolare, gli inibitori di traduzione sono stati mostrati ad incidere mRNA associazione 8,13. Inoltre, caratteristiche tradotte come l'AUG, sequenza di targeting mitocondriale (MTS) o regioni ORF sono stati indicati come ausilio nella localizzazione 8,11,15. Hsp70-famiglia di proteine chaperone e proteina recettore sulla membrana esterna mitocondriale anche stati mostrati per sostenere associazione mRNA, ulteriormente implicando che funzioni codificate proteine sono importanti per la localizzazione mRNA 16. Questo è coerente con un modello in cui la proteina-ribosoma emergente serve come elemento di riconoscimento per il targeting complesso mRNA-ribosoma-proteina ai mitocondri 17.
Traduzione localizzata vicino mitocondri è stato studiato con vari metodi, tra cui la microscopia elettronica (per visualizzare ribosomi) 3, FISH 9, RNA verde (per rilevare specifici mRNA) 11, e frazionamento biochimico (a rilevare sia RNA e ribosomi) 10,18. Mentre i metodi precedenti rilevano localizzazione in vivo e può permettere la visualizzazione delle dinamiche di trasporto, quest'ultimo permette la rilevazione di molti mRNA differenti in un singolo esperimento. Inoltre, per i domini biochimica codifica frazionamento o non codificanti non hanno bisogno di essere alfiltranti quindi i loro ruoli specifici può essere valutato. Frazionamento biochimico è stato utilizzato con successo per molti anni, per l'isolamento di molti compartimenti cellulari diversi. I suoi principi e le limitazioni sono ben stabiliti, e si può facilmente modificare i protocolli esistenti per scopi diversi. La strumentazione necessaria è standard in molti laboratori, quindi di solito è il primo metodo di scelta per studiare la localizzazione intracellulare. Descriviamo un protocollo che è stato ottimizzato per l'isolamento di mRNA mentre ribosomi sono associati con i mitocondri. Questo protocollo è quindi ottimale per studiare fattori coinvolti in una versione localizzata vicino mitocondri.
Protocol
Representative Results
Discussion
I progressi tecnologici nella diagnostica per immagini hanno dato strumenti ad alta risoluzione per studiare la localizzazione mRNA. Oggi, si può misurare il movimento di una singola molecola di mRNA a scala msec 23-26. Tuttavia, gli approcci tradizionali biochimici, come quello sopra descritto, sono anche informativo e sono preferibili in alcuni casi. Isolamento Biochemical permette la purificazione di un grande repertorio di mRNA e proteine, ed è quindi preferibile per studi genoma di ampiezza. In un sing…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Drs. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pini e Doron Rapaport aiuto e commenti durante la creazione di questo protocollo. Questo lavoro è finanziato dalla ISF (codice di autorizzazione 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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