현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리
Summary
미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.
Abstract
미토콘드리아 단백질의 대부분은 핵으로 인코딩 및 세포 기관으로 수입 할 필요가있다. 단백질이 미토콘드리아 근처에 합성하는 동안 수입이 발생할 수 있습니다. 이 가능성에 대한 지원은 미토콘드리아 단백질을 코딩하는 많은의 mRNA가 미토콘드리아 부근에 지역화하는 것으로 된 최근 연구에서 파생됩니다. 함께 외부 막과 리보솜 협회 이전 시위, 이러한 결과는 현지화 번역 과정을 제안한다. 현지화 번역, 수입 효율을 향상 독특한 규제 사이트를 제공하고 자궁외 표현의 경우를 최소화 할 수 있습니다. 다양한 방법이 지역화 된 번역을 중재 요인과 요소를 특성화하기 위해 사용되어왔다. 이 가운데 표준 차동 원심 분리하여 세포 내 분획이다. 이 프로토콜은 하나의 절차에서 mRNA가 리보솜 단백질의 분리의 장점이 있습니다. 이들은 다음 다양한 분자량 및 BI에 의해 특성화 될 수있다ochemical 방법. 또한, transcriptomics 및 프로테오믹스 방법하여 게놈 넓은 통찰력에게 수, 생성 된 물질에 적용 할 수 있습니다. 이러한 연구의 모델 생물로 효모의 활용 속도, 비용과 단순성의 이점이있다. 또한, 진보 된 유전 도구와 사용 가능한 삭제 균주 후보 요인의 검증을 용이하게한다.
Introduction
진핵 세포는 특정 기능을 가지는 별개의 구획으로 구성되어 있습니다. 그 기능을 수행하기 위해, 각 구획의 활동에 필수적인 단백질의 고유 한 집합이 포함되어 있습니다. 이 단백질은 자신의 구획에 접근 통해 가능한 메커니즘은 로컬 라이즈 1,2입니다. 이 과정에서, 단백질은 리보솜 군데 위치에서 mRNA를 대상으로 합성된다. 현지화 번역의 가능성 장점이 단백질의 타겟팅의 효율성을 증가하는 가운데, 단백질 보호자에 필요한 감소하고, 사이트 별 규제 메커니즘을 가능하게한다. 또한, 지역화의 mRNA와 리보솜은 일반 번역이 억제되어 세포 스트레스의 경우 번역 기계의 외딴 저장 될 수 있습니다.
미토콘드리아는 최근 몇 년 동안 현지화 번역을 연구 중심 모델이되었다. 대부분의 미토콘드리아 단백질은 세포질로 번역 핵, 인코딩 된와 세포 기관으로 수입. 증거의 다양한 라인이 단백질의 많은 지역의 번역 과정을 통해 생산되는 것을 나타냅니다. 처음에는 전자 현미경 및 생화학 적 분류 연구는 미토콘드리아 3-5과 관련된 변이를 발견했습니다. 다음 만 cotranslational 방식으로 6,7 가져온 것으로 나타났다 특정의 mRNA에 일에 의해 생체 내에서 뒷받침 이러한 연구. 미토콘드리아와의 mRNA 협회의 게놈 넓은 연구의 mRNA의 상당 부분이 미토콘드리아 부근 8-10로 지역화 된 것으로 나타났다. 이들의 mRNA 중 일부는 또한 생선이나 MTAG 9, 11 등의 생체 내 형광 방법을 특징으로했다. 이 협회의 직선적 해석은 이들의 mRNA가 현지화 번역에 대한 템플릿 역할을한다는 것입니다.
이들의 mRNA가 미토콘드리아에 접근하는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 비 암호화 도메인 (대부분의 significantlY 3 '의 UTRs)은 미토콘드리아 12 mRNA의 연관에 관여하는 것으로 나타났다. 이 도메인은 자신의 전송을 중재 RNA 결합 단백질에 결합 부위의 역할을 할 가능성이있다. 효모의 연구는 단백질의 PUM 가족 (Puf3)의 회원이 미토콘드리아 8,13와 mRNA의 연결을 지원하는 것으로 나타났다. 다른 가족 구성원의 기능을 기반으로 Puf3에 대한 그럴듯한 역할은 mRNA의 라우팅 14 엉 동안 번역을 억제하는 것입니다. 따라서,의 mRNA는 비 암호화 영역과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질에 의해, 비 번역 상태로 운송 할 수있다. 또한, 작품의 큰 몸은 단백질이 합성되는 동안 전송이 발생하는 것이 좋습니다. 특히, 번역 억제제의 mRNA에게 연결 8,13에 영향을 표시했다. 또한, 같은 8월로 번역 기능은, 미토콘드리아 타겟팅 순서 (MTS) 또는 ORF 영역은 현지화 8,11,15에 도움을 나타내었다. HSP70 세대 단백질 채널미토콘드리아 외부 막에 aperone 단백질 수용체는 또한 추가로 인코딩 된 단백질의 기능은 mRNA의 현지화 16 중요하다는 것을 의미한다, mRNA의 연결을 지원하기 위해 표시했다. 이는 리보솜 대두 단백질이 미토콘드리아에 17의 mRNA-리보솜 단백질 복합체를 표적 인식을위한 요소로서 기능하는 모델과 일치한다.
미토콘드리아 부근의 현지화 된 번역은 전자 현미경 (리보솜을 시각화하기 위해) 3 FISH 9, (특정의 mRNA를 검출하는) 녹색 RNA 11, 생화학 적 분류 (RNA와 리보솜을 모두 감지하는) 10,18 등 다양한 방법으로 연구 하였다. 전자의 방법은 생체 내에서 현지화를 감지하고 전송 역학의 시각화를 허용 할 수 있지만, 후자는 하나의 실험에서 여러 가지의 mRNA를 검출 할 수 있습니다. 또한, 생화학 분류 코딩 또는 비 암호화 도메인에 대해 알 수 필요가 없습니다까지 입력 그러므로 특정 역할이 평가 될 수있다. 생화학 분별 성공적 많은 다른 세포 구획 분리를 위해 수년 동안 사용되어왔다. 그 원칙과 한계는 잘 설립하고, 하나는 쉽게 다른 목적을 위해 기존의 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 필요한 장비, 따라서 그것은 일반적으로 세포 내 현지화를 공부에 대한 선택의 첫 번째 방법이다, 많은 실험실에서 표준입니다. 우리는 리보솜이 미토콘드리아와 관련된 동안의 mRNA의 분리에 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 미토콘드리아 부근의 현지화 번역에 관련된 요인을 공부에 최적입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이미징 기술의 발전은 mRNA의 현지화를 연구하는 높은 해상도 도구를 산출했다. 오늘날, 하나는 msec의 시간 스케일 23-26이라도 단일의 mRNA 분자의 움직임을 측정 할 수있다. 그러나, 전통적인 생화학 적 접근법은, 상술 한대로, 또한 유익한 일부 경우에 바람직하다. 생화학 격리의 mRNA 및 단백질의 큰 레퍼토리의 정화를 허용하고, 게놈 넓은 연구에 대한 것이 바람직하다. 하나의 분리, 하나?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Drs에 감사드립니다. Erez Eliyahu, 다니엘 멜라 메드, Ophry 소나무와이 프로토콜의 설립시 도움과 의견을 주셔서 도론 라파. 이 작품은 ISF (허가 번호 1193년에서 1109년까지)에 의해 투자된다.
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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