Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada
Summary
Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.
Abstract
La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo y deben ser importados en el orgánulo. Import puede ocurrir mientras que la proteína se sintetiza cerca de las mitocondrias. El apoyo a esta posibilidad se deriva de estudios recientes, en los que se muestran muchos mRNAs que codifican proteínas mitocondriales estar localizado en las proximidades mitocondrias. Junto a las manifestaciones anteriores de asociación ribosomas 'con la membrana externa, estos resultados sugieren un proceso de traducción localizada. Dicha traducción adaptada puede mejorar la eficiencia importan, suministran sitios únicos de regulación y reducir al mínimo los casos de expresión ectópica. Diversos métodos han sido utilizados para caracterizar los factores y elementos que median la traducción localizada. Estándar entre ellos es de fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Este protocolo tiene la ventaja de aislamiento de ARNm, ribosomas y proteínas en un solo procedimiento. Estos pueden ser caracterizados por diversas molecular y bimétodos ochemical. Además, transcriptómica y proteómica métodos se pueden aplicar al material resultante, por ende facilitaría ideas de todo el genoma. La utilización de la levadura como organismo modelo para tales estudios tiene las ventajas de velocidad, los costos y simplicidad. Además, las herramientas genéticas avanzadas y supresión cepas disponibles facilita la verificación de los factores de candidatos.
Introduction
Las células eucariotas están organizados en compartimentos distintos que tienen funciones específicas. Para cumplir su función, cada compartimiento contiene un conjunto único de las proteínas que son esenciales para su actividad. Un posible mecanismo a través del cual estas proteínas se acercan a su compartimento es por 1,2 localizada traducción. En este proceso, la proteína se sintetiza en su destino por los ribosomas y mRNAs que se encuentran allí. Entre las ventajas probables de traducción adaptada aumentan la eficiencia de la focalización de proteínas, disminución de la necesidad de chaperones de la proteína, y permitiendo a los mecanismos de regulación específicos del sitio. Además, los ARNm y ribosomas localizados pueden ser un depósito aislado de la maquinaria de traducción en los casos de estrés celular, cuando se inhibe la traducción general.
Las mitocondrias se convirtió en los últimos años un modelo central para estudiar traducción localizada. La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo, traducido en el citosol,e importado en el orgánulo. Varias líneas de evidencia indican que muchas de estas proteínas son producidas a través de un proceso de traducción local. Inicialmente, los estudios de microscopía electrónica y de fraccionamiento bioquímico detectan los ribosomas asociados con las mitocondrias 3-5. Estos estudios en los que luego corroboraron in vivo por el trabajo en los ARNm específicos, que se encontraron se importen solamente de una manera cotraduccional 6,7. Los estudios del genoma completo de los ARNm asociación con mitocondrias revelaron que una fracción significativa de los ARNm se localiza en las proximidades mitocondrias 8-10. Algunos de estos ARNm se caracterizaron además por fluorescencia in vivo métodos, como el pescado o MTag 9,11. Una interpretación sencillo de esta asociación es que estos mRNAs sirven como moldes para la traducción localizada.
Los mecanismos por los que estos ARNm se acercan a las mitocondrias son desconocidos. Dominios no codificantes (más significantly 3 'UTR), se mostró a participar en el ARNm asociación a la mitocondria 12. Estos dominios son probablemente para servir como un sitio de unión a las proteínas de unión al ARN que median su transporte. Los estudios en levadura revelaron que un miembro de la familia de proteínas PUM (Puf3) apoya asociación ARNm con mitocondrias 8,13. Un papel plausible para Puf3, que se basa en las funciones de otros miembros de la familia, es para inhibir la traducción mientras que el ARNm está en ruta 14. Por lo tanto, los ARNm pueden ser transportados en un estado no traducida, por las proteínas de unión de ARN que interactúan con regiones no codificantes. Por otra parte, un gran cuerpo de trabajo sugiere que el transporte se produce mientras se sintetiza la proteína. En particular, los inhibidores de la traducción, se mostró a afectar ARNm asociación 8,13. Además, características traducidas tales como el AUG, secuencia de direccionamiento mitocondrial (MTS) o regiones ORF se muestran para ayudar en la localización 8,11,15. Proteína Hsp70 familiar chaperone y receptor de la proteína en la membrana externa de la mitocondria también se muestran para apoyar asociación ARNm, lo que implica que más características codificada en proteínas son importantes para la localización del mRNA 16. Esto es consistente con un modelo en el que la proteína ribosoma-emergente sirve como elemento de reconocimiento para la orientación complejo proteína ARNm-ribosoma a la mitocondria 17.
Traducción localizada cerca de la mitocondria fue estudiada por varios métodos, incluyendo la microscopía electrónica (para visualizar los ribosomas) 3, FISH 9, ARN verde (para detectar ARNm específicos) 11, y el fraccionamiento bioquímico (para detectar tanto el ARN y ribosomas) 10,18. Mientras que los métodos antiguos detectar la localización in vivo y pueden permitir la visualización de la dinámica de transporte, este último permite la detección de muchos ARNm diferentes en un solo experimento. Además, para los dominios de codificación de fraccionamiento bioquímico o no codificantes no necesitan ser colcados, por lo tanto, sus funciones específicas se puede evaluar. Fraccionamiento bioquímico ha sido utilizado con éxito durante muchos años, para el aislamiento de muchos diferentes compartimentos celulares. Sus directores y limitaciones están bien establecidos, y uno puede fácilmente modificar los protocolos existentes para diferentes propósitos. La instrumentación necesaria es estándar en muchos laboratorios, por lo que suele ser el primer método de elección para el estudio de la localización intracelular. Se describe un protocolo que se ha optimizado para el aislamiento de ARNm, mientras que los ribosomas están asociados con las mitocondrias. Por tanto, este protocolo es óptimo para los factores implicados en la traducción localizada cerca de las mitocondrias estudiando.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los avances tecnológicos en las imágenes habían dado las herramientas de alta resolución para estudiar la localización del mRNA. Hoy en día, se puede medir el movimiento de incluso una sola molécula de ARNm en la escala de tiempo mseg 23-26. Sin embargo, los enfoques bioquímicos tradicionales, como el descrito anteriormente, también son informativos y son preferibles en algunos casos. Aislamiento bioquímica permite la purificación de un gran repertorio de los ARNm y proteínas, y por tanto es prefe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Dres. Erez Eliyahu, Daniel Melamed, Ophry Pines y Doron Rapaport ayuda y comentarios durante la creación de este protocolo. Este trabajo está financiado por la ISF (número de concesión 1193-1109).
Materials
| Yeast Extract | |||
| BactoPeptone | |||
| Galactose | Do not autoclave Galactose | ||
| Growth medium | For mitochondrial enrichment, you should use any non- fermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose | ||
| 0.1 M TrisHCl pH9.4 | |||
| 30 mM TrisHCl pH7.6 | |||
| Dithiothreitol (DTT) | |||
| 10 mM DTT Buffer | 0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time | ||
| 1.2 M Sorbitol | |||
| 4 mM KH2PO4 | |||
| 16 mM K2HPO4 | |||
| 0.2μm filter | |||
| Zymolyase Buffer | 1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2μm) and keep at room temperature for future use | ||
| Zymolyase 20T | 20,000 U/gr | ||
| Recovery medium | Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol | ||
| 0.1 mg/mL Cycloheximide (CHX) | |||
| 0.6 M Mannitol | |||
| 5 mM MgAc | |||
| 100 mM KCl | |||
| 0.5 mg/mL Heparin | |||
| 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) | |||
| Mannitol Buffer | 0.6 M Mannitol, 30 mM TrisHCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/mL Heparin, 0.1 mg/mL CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold | ||
| 8M Guanidinium-HCl | |||
| 100% and 70% Ethanol (EtOH) | |||
| 3 M Sodium Acetate pH5.2 | |||
| 10 M LiCl stock solution | |||
| 250 mM Tris HCl pH 6.8 | |||
| SDS | |||
| Glycerol | |||
| β-mercaptoethanol | |||
| Bromophenolblue | |||
| 4xLSB | 250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol and 0.02% Bromophenol blue | ||
| Dounce homogenizer of 15-ml capacity equipped with tight- fitting pestle |
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