التحليل السريع واستكشاف الإسفار الميكروسكوب الصور
Summary
نحن هنا وصف سير العمل بسرعة لتحليل واستكشاف مجموعات من الصور مضان المجهري باستخدام PhenoRipper، منصة تحليل الصورة وضعت مؤخرا.
Abstract
على الرغم من التقدم السريع في الإنتاجية العالية المجهري، كمي المقايسات الصورة القائمة لا تزال تشكل تحديات كبيرة. في حين أن مجموعة متنوعة من أدوات تحليل الصور المتخصصة المتاحة، معظم سير العمل التقليدية القائمة صورة التحليل بوجود منحنيات التعلم حاد (لضبط المعلمات التحليل) وينتج في أوقات التحول الطويلة بين التصوير والتحليل. على وجه الخصوص، وتجزئة الخلية، وعملية تحديد الخلايا الفردية في صورة، هو عقبة رئيسية في هذا الصدد.
هنا نقدم بديل، الخلية خالية من تجزئة العمل على أساس PhenoRipper، وهو منصة البرمجيات مفتوحة المصدر مصممة لتحليل السريع واستكشاف الصور المجهري. هو الأمثل لخطوط الأنابيب المعروضة هنا للصور المناعي المجهري الثقافات الخلية ويتطلب الحد الأدنى من تدخل المستخدم. في غضون نصف ساعة، ويمكن PhenoRipper تحليل البيانات من تجربة 96 جيدا نموذجية وتوليد ملامح الصورة. يمكن للمستخدمينثم بصريا استكشاف البيانات الخاصة بهم، وأداء مراقبة الجودة على تجربتهم، وضمان استجابة للاضطرابات والتحقق من استنساخ مكررات. هذا يسهل دورة التقييم السريع بين التحليل والتجربة، وهو أمر حاسم خلال الفحص الأمثل. هذا البروتوكول هو مفيد وليس مجرد تحليل مرور الأول لمراقبة الجودة، ولكن أيضا يمكن أن تستخدم كحل نهاية إلى نهاية، وخاصة بالنسبة للفحص. سير العمل الموصوفة هنا إلى جداول مجموعات كبيرة من البيانات مثل تلك الصادرة من شاشات عالية الإنتاجية، ولقد ثبت لظروف تجريبية بواسطة مجموعة النمط الظاهري بدقة أكثر من مجموعة واسعة من النظم البيولوجية. يوفر واجهة بديهية PhenoBrowser إطارا لاستكشاف الفضاء المظهري وتتصل خصائص الصورة إلى الشروح البيولوجية. أخذت معا، فإن بروتوكول الموصوفة هنا خفض الحواجز التي تحول دون اعتماد التحليل الكمي للشاشات الصورة القائمة.
Introduction
على مدى العقد الماضي، أعطت التقدم السريع في تكنولوجيا التصوير العديد من مختبرات القدرة على أداء عالية الإنتاجية المجهري. تحول التحدي الآن من واحدة من التصوير إلى واحد من التحليل. كيف يمكننا أن تميز، قارن، واستكشاف سيل من الظواهر المعقدة حتى الآن خفية إنشاؤها بواسطة عالية الإنتاجية الشاشة التصوير نموذجية؟
وقد منح عدد من منصات صورة التحليل والمعلوماتية مستخدمين أدوات العمل المتطورة 1-3 لاستخراج المعلومات البيولوجية من مجموعات كبيرة من الصور. ومع ذلك لا تزال هناك الكثير من العقبات كبيرة في تحليل البيانات من على شاشات الصورة القائمة على الإنتاجية العالية. الصعوبات التي ينطوي مع اختيار الأوصاف المناسبة للصور وضبط من المعلمات حسابي (لنظام الفائدة) غالبا ما تؤدي في أوقات الإعداد الطويلة، لا سيما بالنسبة للمستخدمين بدون خبرة صورة التحليل. على وجه الخصوص، وتجزئة الخلية، وعملية تحديد الخلايا الفردية فين الصورة، هو عقبة رئيسية في هذا الصدد. تجزئة يمكن أن تكون حساسة للغاية لمعلمات التجريبية مثل نوع من الخلايا، كثافة الخلية وعلامات الحيوية، وكثيرا ما يتطلب التكيف المتكررة لمجموعة البيانات الكبيرة. لهذه الأسباب، تحليل الصور غالبا ما يكون خطوة مستقلة، محطة يؤديها المتخصصين بدلا من جزءا لا يتجزأ من سير العمل التجريبية. هذا ما يحول دون دورة التقييم السريع بين التحليل والتجربة، جزءا أساسيا من التنمية الفحص.
نحن هنا وصف سير عمل البديلة التي هو الأمثل لارتفاع الإنتاجية مضان المجهري ويتجنب العديد من الصعوبات المذكورة آنفا. تحقيقا لهذه الغاية، ونحن الاستفادة من PhenoRipper 4، منصة برمجيات المصدر المفتوح للاستكشاف وتحليل الصور المجهري السريع. بشكل ملحوظ، PhenoRipper يتجنب العديد من التحديات التي ينطوي مع تجزئة الخلية من خلال عدم محاولة التعرف على الخلايا واحد. بدلا من ذلك، PhenoRipper يقسم الصور إلى بكسلكتل من حجم التحت خلوية وتميز في الصور من حيث الكتل التي تحتوي عليها. على وجه التحديد، لمحات PhenoRipper كتل من حيث المستندة إلى colocalization علامة الميزات وتلقائيا يحدد 4 أنواع كتلة الأكثر تمثيلا في الصور التدريب. PhenoRipper ثم يعين على كل كتلة الأكثر مماثلة نوع كتلة ممثل، وأخيرا الصور يميز على أساس أنواع من الكتل التي تحتوي عليها.
بالمقارنة مع النهج القائم على خلية واحدة أكثر تقليدية، وهذا النهج يتطلب الحد الأدنى من ضبط والخبرة ما يرام. على هذا النحو، يحتاج المستخدمون فقط إلى وضع معلمتين: حجم كتلة وكثافة عتبة (لتجاهل أجزاء noncellular من الصورة)، وكلاهما مع مجموعة ردود الفعل الرسومية. الأهم من ذلك، وقد تبين سير العمل الموصوفة هنا 4 لتوسيع نطاق بسهولة إلى مجموعات البيانات أكبر من ذلك بكثير، حيث السرعة والحد الأدنى من ضبط يوفر وقتا كبيرا ومكاسب الموثوقية. في الممارسة العملية، نجد أن هذا التطبيقصرصور يقلل من الوقت اللازم لإعداد كل من وتشغيلها بواسطة أوامر متعددة من حجم 4.
الناتج الرئيسي لPhenoRipper هو تمثيل مرئي للصورة التشابه، والتي تمكن المستخدم لتحديد مجموعات من الظروف التجريبية التي تسبب الخلايا لعرض الظواهر المشابهة. التجمعات PhenoRipper يجد عادة ما يكون مقارنة "للتفسير البيولوجي" لتلك التي تم إنشاؤها بواسطة أكثر من ذلك، أساليب خلية مقرها تستغرق وقتا طويلا 4. في الممارسة العملية، وهذا يعني أن في كثير من الأحيان، في غضون نصف ساعة من إجراء 96 تجربة جيدة مضان المجهري نموذجي، وهو مجرب بدون خبرة سابقة الصورة التحليل يمكن الحصول على قراءات موثوقة حول أداء التجربة له أو لها. يمكن المجرب ثم البدء في استكشاف العلاقات بين ظروف تجريبية مختلفة وتتعلق هذه العلاقات إلى الظواهر الصورة.
ونحن لشرح سير العمل هذا هنا من خلال تحليل الآثارالمخدرات في صفوف الآلية واضحة على خلايا هيلا ملطخة عن علامات الحمض النووي وهيكل الخلية. تم تجميع الصور من الخلايا تعامل مع نفس الفئة من الأدوية معا، وظهرت الصور رديئة الجودة (تلطيخ التحف، للخروج من خلايا التركيز وهلم جرا)، والقيم المتطرفة، مما يجعلها سهلة لتحديد ويحتمل تجاهل.
في حين أن هذا العمل مفيد لعدد كبير من المقايسات الصورة القائمة، وهناك العديد من الحالات التي يكون فيها بوضوح نهجا مختلفا من المحتمل أن تكون أكثر إفادة. على سبيل المثال، الإخراج من PhenoRipper هو في المقام الأول مقارنة النسبية للأنماط مضان عبر الظروف التجريبية. إذا كان مطلوبا لتوصيف المطلقة سمة محددة خلية واحدة بدلا من ذلك (على سبيل المثال عدد البقع في خلية)، سوف تكون هناك حاجة إلى تحليل واحد المستندة إلى الخلية. مع ذلك، وحتى في هذا النوع من الحالات، ومن المرجح أن كشف التغيرات في هذه الظواهر وحيدة الخلية، وبالتالي PhenoRipper أن تكون أداة مفيدة لفحص الأمثلmization.
Protocol
Representative Results
Discussion
سير العمل الموصوفة هنا يسمح توصيف سريع وسهل والمقارنة بين الصور المجهري. أثبتنا أولا كيف يمكن أن يساعد هذا العمل الأمثل التجربة، على سبيل المثال عن طريق إجراء سريعا لمراقبة الجودة على الصور المجهري. المقبل، أثبتنا قدرته على تحليل البيانات الفرز الفائق الإنتاجية: كن?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر آدم كوستر وجميع الأعضاء الآخرين في Altschuler ووو مختبرات لردود الفعل والمناقشات المفيدة. هذا البحث كان مدعوما من المعهد الوطني للصحة منح R01 GM085442 وCA133253 (SJA)، R01 GM081549 (LFW)، CPRIT RP10900 (LFW)، ومؤسسة وولش I-1619 (SJA) وI-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
Referências
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm – an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. 2, 1139-1142 (2004).
