Экспресс-анализ и разведка флуоресцентной микроскопии Images
Summary
Здесь мы опишем рабочий процесс для быстрого анализа и изучения коллекций флуоресцентной микроскопии изображений с помощью PhenoRipper, недавно разработанной анализа изображений платформу.
Abstract
Несмотря быстрого прогресса в высокой пропускной микроскопии, количественные изображений на основе анализов по-прежнему представляют значительные трудности. В то время как множество специализированных инструментов анализа изображений доступны, большинство традиционных рабочие процессы анализа изображений на основе иметь крутых кривых обучения (для тонкой настройки параметров анализа) и привести к увеличению времени оборота между визуализации и анализа. В частности, сотовый сегментация, процесс идентификации отдельных клеток в изображении, является серьезной проблемой в этом отношении.
Здесь мы представляем альтернативное, сотовый сегментации без рабочего процесса на основе PhenoRipper, в программной платформы с открытым исходным кодом, предназначенный для экспресс-анализа и исследования микроскопии изображений. Трубопровод, представленные здесь оптимизирован для иммунофлюоресценции микроскопии изображений клеточных культур и требует минимального вмешательства пользователя. В течение получаса, PhenoRipper может анализировать данные из типичного эксперимента 96-луночный и генерации профилей изображения. Пользователи могутзатем визуально исследовать свои данные, осуществлять контроль качества на их опыте, обеспечить реакцию на возмущения и проверить воспроизводимость повторах. Это облегчает быстрый цикл обратной связи между анализом и эксперимента, которая имеет решающее значение в процессе оптимизации анализа. Этот протокол полезен не только как первый проход анализа для контроля качества, но также может быть использован в качестве раствора из конца в конец, особенно для скрининга. Рабочий процесс, описанный здесь масштабируется для больших объемов данных, таких, как генерируемых экранов высокой пропускной, и было показано, что группы экспериментальных условиях по фенотипу точно в широком диапазоне биологических систем. Интерфейс PhenoBrowser обеспечивает интуитивный рамки для изучения фенотипическую пространство и относятся изображения свойства биологических аннотации. Взятые вместе, протокол, описанный здесь снизит барьеры для принятия количественный анализ изображений на основе экранов.
Introduction
За последние десять лет, быстрое развитие технологий визуализации дали много лабораторий способность выполнять с высокой пропускной микроскопии. Задача теперь переместился из одного из изображений к одному из анализа. Как мы можем охарактеризовать, сравнивать и исследовать поток сложных еще тонких фенотипов порожденных типичной экране изображения с высокой пропускной?
Ряд изображений анализ и информатика платформ дали пользователям искушенным Ящики для инструментов 1-3 для извлечения биологическую информацию от больших коллекций изображений. Тем не менее многие значительные препятствия остаются в анализе данных с картинки основе экранов высокой пропускной. Трудности, связанные с выбором соответствующих характеризации изображений и тонкой настройки алгоритмических параметров (к системе интереса) часто приводят к увеличению времени настройки, особенно для пользователей без анализа изображений экспертизы. В частности, сотовый сегментация, процесс идентификации отдельных клеток вн изображение, является серьезной проблемой в этом отношении. Сегментация может быть очень чувствительны к экспериментальных параметров, таких как тип клеток, клеточной плотности и биомаркеров, и часто требуется повторную регулировку для большого набора данных. По этим причинам, анализ изображений часто независимый, терминал шаг осуществляется специалистами, а не составной части экспериментальной рабочего процесса. Это исключает быстрый цикл обратной связи между анализом и эксперимента, важнейшей частью развития анализа.
Здесь мы опишем альтернативный рабочий процесс, который оптимизирован для высокой пропускной флуоресцентной микроскопии и позволяет избежать многих из вышеупомянутых трудностей. С этой целью мы используем PhenoRipper 4, в программной платформы с открытым исходным кодом для быстрого разведки и анализа микроскопических изображений. Важно отметить, что PhenoRipper позволяет избежать многих проблем, связанных с сотового сегментации, не пытаясь определить отдельные клетки. Вместо этого, PhenoRipper изображение разбивается на пиксельблоки субклеточном размера и характеризует изображения в терминах блоков, которые они содержат. В частности, PhenoRipper профили блоки с точки зрения маркеров-колокализации основе особенностей и автоматически определяет 4 самых представительных типов блоков в тренировочных образов. PhenoRipper затем присваивает каждому блоку наиболее близки типа представитель блока, и, наконец, характеризует изображений на основе типов блоков, которые они содержат.
По сравнению с более традиционными одноклеточные подходов, этот подход требует минимального тонкой настройки и опыт. Таким образом, пользователям необходимо только установить два параметра: размер блока и порог интенсивности (для отмены неклеточного частей изображения), оба из которых устанавливаются с графическим обратной связи. Важно отметить, что рабочий процесс, описанный здесь, как было показано 4 легко масштабировать, чтобы значительно большими объемами данных, где скорость и минимальная подстройка обеспечивает большое время и прибыль надежности. На практике мы видим, что это приложениеплотва сокращает время, необходимое как для настройки и запуска по нескольким порядков 4.
Основной выход из PhenoRipper это визуальное представление сходства изображения, что позволяет пользователю определить группы экспериментальных условиях, которые вызывают клетки для отображения сходные фенотипы. Группировки PhenoRipper находит обычно имеют сравнимую «биологический интерпретируемость" для тех, порожденная наиболее трудоемких, методов на основе клеток 4. На практике это означает, что часто, в течение получаса выполнения типичный эксперимент флуоресцентной микроскопии 96-а, экспериментатор без предварительного опыта анализа изображений может получить надежный отсчет о производительности его или ее опыта. Экспериментатор может начать исследовать отношения между различных экспериментальных условиях, касающийся этих отношений, чтобы изображения фенотипов.
Мы демонстрируем этот рабочий процесс здесь, анализируя последствиянаркотиков в различных механических занятий по HeLa клеток, окрашенных для ДНК и цитоскелета маркеров. Изображения клеток, обработанных с тем же классу препаратов были сгруппированы вместе, и качество изображения бедные (окрашивания артефакты, из фокус-клеток и так далее) появились как выбросы, что делает их легко идентифицировать и потенциально отбросить.
В то время как этот рабочий процесс полезен для большого количества изображений на основе анализов, существует четко много ситуаций, когда другой подход потенциально может быть более информативным. Например, выход из PhenoRipper это прежде всего относительное сравнение шаблонов флуоресценции через экспериментальных условиях. Если абсолютный характеристика конкретного одной чертой клетки вместо требовалось (например количество пятен в клетке), одноклеточного на основе анализа потребуется. Тем не менее, даже в такой ситуации, PhenoRipper, вероятно, обнаружить изменения в этих одноклеточных фенотипов и поэтому быть полезным инструментом для анализа Optiзацию.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рабочий процесс, описанный здесь позволяет быстро и легко характеристику и сравнение микроскопии изображений. Мы впервые продемонстрировали, как это рабочий процесс может помочь оптимизации эксперимента, например, быстро обеспечения контроля качества на микроскопии изображений. Да?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Адам Костера и всех других членов лабораториях Альтшулер и Ву для полезных советов и дискуссий. Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставляет R01 GM085442 и CA133253 (ся), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), и Welch Foundation I-1619 (SJA), и я-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
Referências
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm – an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. 2, 1139-1142 (2004).
