Snelle analyse en verkenning van fluorescentiemicroscopie Afbeeldingen
Summary
Hier beschrijven we een workflow voor het snel analyseren en verkennen van collecties van fluorescentie microscopie beelden met behulp PhenoRipper, een recent ontwikkelde beeldanalyse platform.
Abstract
Ondanks de snelle ontwikkelingen in de high-throughput microscopie, kwantitatieve-image-gebaseerde testen vormen nog steeds belangrijke uitdagingen. Terwijl een verscheidenheid aan gespecialiseerde beeldanalyse tools zijn beschikbaar, de meeste traditionele beeld-analyse-gebaseerde workflows hebben steile leercurve (voor fijnafstelling van analyse parameters) en leiden tot lange doorlooptijden tussen beeldvorming en analyse. In het bijzonder cel segmentatie, het proces van identificatie van afzonderlijke cellen in een beeld, is een belangrijk knelpunt in dit verband.
Hier presenteren we een alternatieve, cel-segmentatieloze workflow op basis van PhenoRipper, een open-source software platform dat is ontworpen voor de snelle analyse en verkenning van microscopie beelden. De hier gepresenteerde pijpleiding is geoptimaliseerd voor immunofluorescentie microscopie beelden van celculturen en vereist een minimale tussenkomst van de gebruiker. Binnen een half uur, kan PhenoRipper analyseren van een typische 96-well experiment en het genereren afbeelding profielen. Gebruikers kunnenvervolgens visueel hun gegevens te verkennen, uit te voeren kwaliteitscontrole op hun experiment, verzekeren reactie op verstoringen en check reproduceerbaarheid van herhalingen. Dit vergemakkelijkt een snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, wat cruciaal is tijdens test optimalisatie. Dit protocol is niet alleen nuttig als een eerste doorgang analyse kwaliteitscontrole, maar ook kan worden gebruikt als een end-to-end oplossing, vooral voor screening. De hier beschreven workflow schalen naar grote datasets zoals die gegenereerd worden door high-throughput-schermen, en is aan de groep experimentele omstandigheden aangetoond door fenotype nauwkeurig over een breed scala van biologische systemen. De PhenoBrowser interface biedt een intuïtieve kader om de fenotypische ruimte te verkennen en hebben betrekking beeld eigenschappen aan biologische annotaties. Samen genomen, zal de hier beschreven protocol verlagen de barrières op de aanneming van een kwantitatieve analyse van image-based schermen.
Introduction
In de afgelopen tien jaar hebben snelle ontwikkelingen in de imaging-technologie veel labs krijgt de mogelijkheid om high-throughput microscopie. De uitdaging is nu verschoven van een van beeldvorming om een analyse. Hoe kunnen we karakteriseren, vergelijken, en verken de stortvloed van complexe maar subtiele fenotypes die door een typische high-throughput imaging scherm?
Een aantal imago-analyse en informatica platforms hebben gebruikers geavanceerde gereedschapskisten gegeven 1-3 voor de extractie van biologische informatie uit grote verzamelingen van afbeeldingen. Toch blijven er nog vele belangrijke hindernissen in het analyseren van gegevens van high-throughput-image-based schermen. Problemen in verband met het kiezen van geschikte karakteriseringen van de beelden en fijnafstelling van algoritmische parameters (het systeem van rente) leiden vaak tot lange insteltijden, vooral voor gebruikers zonder beeldanalyse expertise. Vooral cel segmentatie, het identificeren individuele cellen in eenafbeelding n, is een belangrijk knelpunt in dit verband. Segmentatie kunnen zeer gevoelig zijn voor experimentele parameters zoals het type cel, dichtheid en bio-markers, en vereist vaak herhaalde aanpassing voor een grote dataset. Daarom beeldanalyse vaak een onafhankelijke terminal stap uitgevoerd door deskundigen plaats van een integraal deel van het experimentele workflow. Dit voorkomt de snelle feedback cyclus tussen analyse en experiment, een cruciaal onderdeel van assay ontwikkeling.
Hier beschrijven we een alternatieve workflow die is geoptimaliseerd voor high-throughput fluorescentiemicroscopie en vermijdt vele van de bovengenoemde problemen. Hiervoor maken we gebruik van PhenoRipper 4, een open-source softwareplatform voor snelle verkenning en analyse van microscopie beelden. Aanzienlijk, PhenoRipper vermijdt veel van de uitdagingen die betrokken zijn bij cel segmentatie door niet te proberen om enkele cellen te identificeren. In plaats daarvan verdeelt PhenoRipper afbeeldingen in pixelblokken subcellulaire grootte en kenmerkt afbeeldingen in termen van de blokken die ze bevatten. Concreet PhenoRipper profielen blokken in termen van marker-colocalization gebaseerde functies en identificeert automatisch 4 de meest representatieve soorten blok in de training beelden. PhenoRipper dan toekent aan elk blok het meest vergelijkbaar type representatieve blok, en tenslotte kenmerkt Afbeeldingen op basis van de aard van de blokken die ze bevatten.
Vergelijking met de meer traditionele single-cel-gebaseerde benaderingen, deze aanpak vereist een minimale fine tuning en expertise. Als zodanig, gebruikers hoeven slechts twee parameters: de blokgrootte en een drempel intensiteit (op niet-cellulaire delen van een beeld ontdoen), beide zijn ingesteld met grafische feedback. Belangrijk is dat de hier beschreven workflow aangetoond 4 gemakkelijk schalen naar veel grotere datasets, waarbij de snelheid en de minimale fine tuning biedt grote tijd en betrouwbaarheid winsten. In de praktijk zien we dat deze appvoorn reduceert de tijd die nodig is, zowel voor de installatie en actief door meerdere ordes van grootte 4.
De primaire uitvoer van PhenoRipper is een visuele weergave van beeld gelijkenis, waarmee de gebruiker groepen experimentele omstandigheden die veroorzaken cellen vergelijkbare fenotypen laten identificeren. De groeperingen PhenoRipper Typisch voelt hebben vergelijkbare "biologische uitlegbaarheid" die gegenereerd door tijdrovender, cel-gebaseerde methoden 4. In de praktijk betekent dit dat vaak, binnen een half uur van het uitvoeren van een typische 96-well fluorescentie microscopie experiment, een experimentator zonder voorafgaande beeldanalyse ervaring kan een goede weergave over de prestaties van zijn of haar experiment te krijgen. De onderzoeker kan dan beginnen met het verkennen van de relaties tussen de verschillende experimentele condities en in verband deze relaties op de foto fenotypes.
We tonen deze workflow hier door het analyseren van de effectenvan drugs in verschillende mechanistische lessen op HeLa-cellen gekleurd voor DNA en cytoskelet markers. Beelden van cellen behandeld met dezelfde klasse van drugs werden gegroepeerd, en slechte kwaliteit beelden (kleuring artefacten, onscherp cellen enzovoort) verscheen als uitschieters, waardoor ze gemakkelijk te identificeren en wellicht gooi.
Hoewel deze werkstroom is nuttig voor een groot aantal beeld-gebaseerde testen zijn duidelijk veel situaties waarin een andere aanpak potentieel informatief zijn. Bijvoorbeeld, de uitvoer van PhenoRipper vooral een relatieve vergelijking van fluorescentie patronen in experimentele omstandigheden. Indien een absolute karakterisering van specifieke cel trait plaats is vereist (bijvoorbeeld het aantal spikkels in een cel), wordt een enkele-cel gebaseerde analyse vereist. Niettemin, zelfs in dergelijke situatie PhenoRipper waarschijnlijk veranderingen in deze eencellige fenotypes detecteren en daarom een nuttig instrument voor analyse optimaalmization.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier beschreven workflow zorgt voor een snelle en eenvoudige karakterisering en vergelijking van microscopie beelden. We eerst aangetoond hoe deze workflow experiment optimalisatie, bijvoorbeeld kan helpen door snel uitvoeren van kwaliteitscontrole op microscopie beelden. Vervolgens toonden we het potentieel voor het analyseren hoog-gegevens: we konden groep geneesmiddelen op basis van hun werkingsmechanisme. De groepering van geneesmiddelen was vergelijkbaar met die gevonden met complexere 6, hoewel Pheno…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Adam Coster en alle andere leden van de Altschuler en Wu labs voor nuttige feedback en discussies. Dit onderzoek werd gesteund door de National Institute of Health verleent R01 GM085442 en CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW) en de Welch Stichting I-1619 (SJA) en I-1644 (LFW).
Materials
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2000 of 5mg/ml stock |
| Marker phalloidin-Alexa488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5mg in 1ml PBS + 1ml glycerol |
| Aldosterone | concentration used :0.2 μM | ||
| Apicidin | concentration used :20 μM | ||
| Colchicine | concentration used :0.16 μM | ||
| Cortisol | concentration used :0.2 μM | ||
| Dexamethasone | concentration used :0.2 μM | ||
| Docetaxel | concentration used :0.2 μM | ||
| M344 | concentration used :20 μM | ||
| MS-275 | concentration used :5 μM | ||
| Nocodazole | concentration used :0.3 μM | ||
| Prednisolone | concentration used :0.2 μM | ||
| RU486 | concentration used :0.2 μM | ||
| Scriptaid | concentration used :70 μM | ||
| Taxol | concentration used :0.3 μM | ||
| Trichostatin A | concentration used :0.2 μM | ||
| Vinorelbine | concentration used :0.3 μM |
Referências
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., Goldberg, I. G. Pattern Recognition Software and Techniques for Biological Image Analysis. PLoS Comput. Biol. 6, (2010).
- Rajaram, S., Pavie, B., Wu, L. F., Altschuler, S. J. PhenoRipper: software for rapidly profiling microscopy images. Nat. Methods. 9, 635-637 (2012).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
- Slack, M. D., Martinez, E. D., Wu, L. F., Altschuler, S. J. Characterizing heterogeneous cellular responses to perturbations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 19306-19311 (2008).
- Wolf, D. E., Samarasekera, C., Swedlow, J. R. Quantitative analysis of digital microscope images. Methods Cell. Biol. 81, 365-396 (2007).
- Zwier, J. M., Van Rooij, G. J., Hofstraat, J. W., Brakenhoff, G. J. Image calibration in fluorescence microscopy. J Microsc. 216, 15-24 (2004).
- Shamir, L., et al. Wndchrm – an open source utility for biological image analysis. Source Code Biol. Med. 3, 13 (2008).
- Hamilton, N. A., Wang, J. T., Kerr, M. C., Teasdale, R. D. Statistical and visual differentiation of subcellular imaging. BMC Bioinform. 10, 94 (2009).
- Huang, K., Murphy, R. F. Automated classification of subcellular patterns in multicell images without segmentation into single cells. 2, 1139-1142 (2004).
