Summary
입자 추적 microrheology은 비파괴 정량 및 공간적 차원 종양 모델에서 세포 외 기질 (extracellular matrix) 기계적 성질의 변화를 매핑하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
기계 미세 자체가 리모델링 복잡한 양방향 mechanosensitive 상호 작용의 한 부분으로서 수정 종양의 성장 동작 및 신호의 중요한 규칙, 역할을 보여왔다. 생물학적으로 중요한 3D 종양 모델의 개발은 종양 성장에 대한 매트릭스의 레올 로지에 미치는 영향에 대한 역학적 연구를 촉진하고 있지만, 종양에 의해 유도 된 기계적 환경 매핑 변화의 역 문제는 도전 남아있다. 여기, 우리는 종 방향으로 현장에서, 종양 미세 환경의 물리적 변화를 모니터링하기위한 강력하고 실행 가능한 접근 방법의 일환으로 췌장암의 3D 모델과 함께 입자 추적 microrheology은 (PTM)의 구현을 설명합니다. 여기에 설명 된 방법론과 형광 표지 프로브가 균일하게 포 배포 모델 세포 외 기질 I 콜라겐 유형의 (ECM) 지지체에 포함 체외 3D 모델을 준비하는 시스템 통합구성비와 표본 전체에 시간에 따른 microrheology은 측정. 체외 종양 도금 및 멀티 웰 이미징 플레이트를 사용하여 병렬 상태에서 조사됩니다. 정해진 방법에 그리기, 추적 조사의 움직임 동영상은 복잡한 주파수 의존 점탄성 전단 계수, G * (ω)를보고하는 일반화 된 스톡스 아인슈타인 관계 (GSER)를 통해 변환됩니다. 이 방법은 이미지를 기반으로하므로, 기계적 특성도 동시에 3D 종양의 크기와 표현형의 질적 변화를보고 큰 투과광 공간 필드에 매핑됩니다. 현지화 침입에 의한 매트릭스 저하뿐만 아니라 시스템 교정과 관련된 하위 지역에 기계 응답을 대조 보여주는 대표적인 결과는 검증 데이터가 제공됩니다. 일반적인 실험 오류와 이러한 문제의 문제 해결에서 바람직하지 않은 결과도 제시된다. 이 프로토콜에서 구현 된 96 - 웰 배양 판 3D 포맷는 C치료 심사 분석 또는 기계적 미세 환경에 대한 치료 또는 생화학 적 자극의 영향에 새로운 통찰력을 얻을 수있는 분자 이미징 microrheology은 측정의 상관 관계에 onducive.
Introduction
그것은 암 세포가 아닌 악성 포유류의 상피 세포에서와 같이, 주변의 세포 외 기질 (ECM) 및 기타 미세 환경의 구성 요소 1-9의 기계 및 생물 물리학 적 특성에 매우 민감하다는 문헌 기록의 성장 몸에서 분명하다. 우아한 기계론의 연구는 악성 성장의 행동과 형태 형성 2,3,10,11을 조절하는 복잡한 mechanosensitive 신호 파트너로 세포 강성의 역할에 대한 통찰력을 제공하고 있습니다. 이 작품은 생물학적으로 관련 조직의 구조를 복원하고 조정할 수있는 기계와 발판 재료의 성장 및 광학 현미경 12-19으로 영상화 할 수있는 시험 관내 종양 모델에서 3D의 개발에 의해, 특히 촉진하고있다. 그러나, 종양 차례로 암 세포가 자신의 주변의 레올 수정 통해 미세 사이 mechanoregulatory이 대화의 다른 쪽은, 다소 남아공부하기가 더 어렵다. 예를 들어, 침략 과정에서, 종양의 주변에서 세포 차례의 mechanosensitive 성장의 행동에 영향을 미치는 ECM 20-22의 지역이 저하 될 그 중간 엽 전이 (EMT)로 상피를 거쳐 매트릭스 메탈로 (MMPs의)의 발현을 증가시킬 수 있습니다 다른 근위부 종양 세포. 생화학 다양한 공정을 통해 암 세포는 지속적으로 다른 시간에 서로 다른 프로세스에 맞춰 상하 그들의 환경의 로컬 강성 다이얼. 여기에서 설명하는 방법은 3D 종양 모델과 통합 문화를 종료하지 않고 생화학 적 표현형의 변화와 종 방향으로 상관 관계가 될 수있다 성장하는 동안 강성과 ECM의 준수 로컬 변경 사항을보고 분석 도구의 필요성에 의해 좌우된다.
이러한 맥락에서 구현하는 적절한 기술의 검색, 입자 추적 microrheology은 (PTM)가 강력한 후보로 나온다.이 방법은, 메이슨과 바이 츠 (23, 24)에 의해 처음 개척, 마이크론 길이의 비늘에서 주파수에 의존하는 복잡한 점탄성 전단 계수, G * (ω)을보고하기 위해 복잡한 유체에 포함 된 추적 프로브의 움직임을 사용합니다. 이러한 일반적인 접근 방식은 부드러운 응축 물질, 콜로이드, 생물 물리학 및 고분자 물리학 25-31에서 다른 응용 프로그램에 적합한 여러 변화와 함께 개발되었습니다. 지역 점탄성의 판독이 문화를 작성할 당시 통합과 성장의 확장 된 기간 동안 그 자리에 남아있다 화학적으로 비활성 추적 프로브의 비파괴 비디오 영상에 의해 제공되기 때문에 PTM은 다른 방법에 비해 어떤 장점이 있습니다. 이것이 반드시 문화의 종단이 필요하고 복잡한 3D 종양 microenvir 내의 포인트 측정보다는 샘플의 벌크 거시적 레올보고 진동형 전단 대량 레오 미터, 금 표준 측정 대조적이다일어나는 장소. 실제로 다수의 연구는 세포의 이동 (32), 확장 구형 (33), 세포 내 레올 로지 (34, 35)에 의해 유도 된 기계적 스트레스와 관련된 변형을 측정하는 또는 암 또는 비 암 세포 주위에 추적 프로브의 움직임 측정을 해석하는 유틸리티를 설명하고있다 기계적 응력과 변형 설계 조직 36, 기공 크기 및 침입 속도 (37) 사이의 관계를 매핑하는 방법. 예컨대 원자력 현미경 (AFM) 등 microrheology은 적합한 다른 기술들이 구현 될 수 있지만, 주로 또한 시료 표면에 점을 프로빙하고 대한 길이 측정 38을 복잡 배양 무균 문제를 일으킬 수있다.
여기에서 우리는 확실하게 공간을 매핑하기위한 비디오 입자 추적 및 분석 방법에 대한 포함 된 형광 프로브와 ECM에 전송하기에 적합한 3D 종양 상체의 성장을위한 방법을 포괄하는 종합적인 프로토콜을 설명문화 시간에 microrheology은 변화. 본 구현, 3D 종양 모델이 형식에 도움이되는 다른 전통적인 분석 (예를 들면, 세포 독성)와 microrheology은 측정의 결합으로 볼 수있는 멀티 웰 형식으로 재배하고 있습니다. PANC-1 세포를 사용하여이 방법의 우리 배양 시험관 차원 상체의이 대표적인 그림에서, 상체 (39) 만, 본원에 기재된 모든 측정을 형성하기 위해 알려진 확립 췌장암 세포주 세포주의 다양한 사용하여 고형 종양 연구 광범위하게 적용될 수있다 3D 문화에 적합합니다. 이 방법은 본질적으로 이미징을 기반으로하기 때문에 그것은 이상적으로 세포의 성장, 이동 및 표현형의 변화를보고보기의 큰 투과광 필드 고해상도 microrheology은 데이터의 공동 등록에 적합합니다. PTM의 구현은 현미경 스테이지 WH 재현성 위치 결정을 가정 이와 같이 투과광 현미경과 통합무형 문화 유산은 모터 상업 위드의 표면 형광 생물 현미경에 일반적으로 사용할 수 있습니다. 아래 개발 된 프로토콜은 합리적으로 장착 된 자동 형광 생물 현미경으로 구현 될 수있다. 이는 오프라인 처리를위한 디지털 비디오 현미경 기가 바이트의 데이터의 획득을 필요로하는 본질적으로 데이터 집약적 인 방법이다.
다음 프로토콜에서, 프로토콜 한 아가 로스 오버레이를 사용하여 여기에 설명되어 있지만, 이러한 매달려 드롭 40, 또는 41 회전 배양 기법과 같은 다른 다양한 방법으로 치환 될 수있는 종양 상체의 초기 제제에 관한 것이다. 프로토콜 2는 다른 방법으로, 체외 3D 종양 캡슐 또는 재 부유 세포의 매립 ECM 12,15에있는 것이 아니라 하나의 미리 형성된 비 부착 상체로 성장 할 수 있지만 콜라겐 지지체에 상체를 포함하는 프로세스를 설명합니다. 후속 프로토콜은 O를위한 절차에 대해 설명합니다각각의 비디오 현미경 데이터를 획득 및 처리하여 시간 분해 microrheology은 측정 btaining. 데이터 처리 (참조 http://www.physics.emory.edu/, MATLAB을 사용하여 원래 광범위하게 다양한 소프트웨어 플랫폼을 위해 개발 된 크로커와 그리어 (42)에 의해 설명 된 알고리즘을 기반으로 PTM을위한 오픈 소스 루틴의 활용 설명 ~ 주 / IDL /).
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Protocol
1. 배양 종양 상체
- 1 % 아가로 오스 용액을 얻었다 아가 로스 0.1 g과 함께 세포 배양 등급의 물 10 ㎖를 혼합한다.
- 96 - 웰 플레이트에 잘으로 아가로 오스 솔루션의 40 μl를 분취하기 전에 70 ° C 이상 (표준 전자 레인지 나 가열 플레이트를 사용하여 약 14 초)에 열 아가로 오스 솔루션입니다.
- 표준 기술을 사용하여 세포를 수확하는 동안 적어도 1 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품어.
- 세포 현탁액의 농도를 결정하기 위하여 hemacytometer를 사용한다.
- 1,000 세포 / ml의 세포 현탁액을 희석하고 잘 경화 아가로 오스 침대를 포함하는이 희석 100 μl를 추가합니다.
- 37 ° C와 5 % CO 2로 설정 배양기에서 하룻밤 진탕 샘플을 놓습니다.
- 통에서 샘플을 제거하고 세포 배양 배지 100 μl를 추가합니다.
- 원하는 직경에 도달 할 때까지 상체를 품어. 예를 들어, 후 구일, SPheroid는 직경이 약 450 μm의 수 있습니다. 이 시간 동안 신선한 성장 배지를 웰에 첨가 할 수 있지만, 이것은 구형 체의 제거를 초래할 것이기 때문에 흡인 피해야한다.
2. ECM에 포함 된 3D 종양 상체를 준비
- 층류 후드 안쪽 필요한 재료와 워크 스테이션을 준비한다.
- 25 부 멸균 수로 2 부 주식 프로브 (2 % 고체)를 추가하여 카르 복실 레이트 - 수정 1 μm의 직경 형광 추적 프로브의 희석 된 혼합물을 준비합니다.
- 냉장고에서 3.1 ㎎ / ㎖ 소 콜라겐의 병을 제거하고 얼음에 놓습니다.
- 나누어지는 125 빈 2 ㎖ 유리 병에 콜라겐 μL.
- 프로브를 배포 짧게 콜라겐과 소용돌이가 들어있는 유리 병에 희석 추적 프로브 솔루션의 50 μl를 추가합니다.
- 적절한 세포 배양 매체 (41)의 전체 볼륨에 대한 페놀 레드 (황색으로 변합니다)를 포함하는 235 μl를 추가합니다간단히 205 ㎖ (반 전체 볼륨)를 제거하고 새로운 2 ㎖ 유리 병에 배치하기 전에 0 ㎖의 소용돌이. 바이알 1은 종양 타원체를 포함하고 약병 2 제어 혼합물 일 것이다.
- 중성 pH (페놀 레드를 포함하는 배양 배지가 빨간색으로 돌려 보내야한다)에 다시 솔루션을 가지고 1 바이알에 1 M NaOH를 1 ~ 2 μl를 추가합니다. 이 혼합물은 얼음에 보관하지 않을 경우 치료 시작이되지 않습니다. 혼합하는 소용돌이 짧게, 즉시 얼음 선반으로 돌아갑니다.
참고 : 회전 타원체 문화와 아가로 오스 침대에서의 제거 9 일 이후 섬세한 작업은 육안으로는 거의 볼 수 있습니다. 해부 현미경의 사용은 일부 사용자에게 도움이 될 수 있습니다. 전송하는 동안 회전 타원체의 무결성을 유지하는 것은 매우 중요합니다. - 넓은 입 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 잘 종양 구형을 포함에서 미디어의 40 μl를 제거합니다. 다음 단계를 수행하는 동안이 40 μl를 유지합니다.
- 볼을 잘 선택하면 구형이전 단계에서 제거되었습니다. 그것이 인 경우, 1 바이알에 구형을 포함하는 40 μl를 추가합니다.없는 경우에, 우물에 40 μl를 배치하고 이전 단계를 반복합니다.
- 조심스럽게 96 - 웰 플레이트의 세 개의 우물에 60 μl의 부분에 혼합물을 전송하기 전에 (이 구형 손상을 줄 수 있습니다, 소용돌이로 교반 위험을 감수하지 않는) 유리 병 1 저어. 잘 회전 타원체를 포함하는 결정 혼합물을 추가 한 후 현미경으로도 각을 검사합니다.
- 추가 1 ~ 2 ㎕의 1 M NaOH를 40 유리 병 2 세포 배양 배지의 μL 및 제어와 같은 96 - 웰 플레이트 및 표시가 잘 빈에이 혼합물의 60 μl를 aliquotting 전에 소용돌이.
- 적어도 1 시간 동안 치료하기 위해 37 ° C의 배양기에서 접시를 놓습니다.
3. 샘플 포인트의 그리드를 구축하고 각 지점에서 비디오를 가지고
- 현미경 단계로 인큐베이터에서 샘플 플레이트를 전송합니다. 샘플의 10 분은 equil 할 수 있도록 허용가열 단계를 사용할 수없는 경우 실내 온도와 ibrate.
- 확실히 그것은이 손상 및 이미징을위한 준비가되어 있는지 확인하기 위해 저전력 대물 렌즈를 이용하여 시료를 관찰합니다. 잘 내 종양의 위치를 확인합니다.
- 하는 방법을 많은 샘플 포인트를 결정합니다. 일반적으로 구형의 주위에 동심원에 분산 각 웰에 20 샘플 포인트는, 충분히 자세한 결과를 생성합니다.
- 각각의 원하는 위치로 무대를 이동하고 x 및 y 좌표 (또는 소프트웨어의 인터페이스은 사용할 수없는 경우 기록을 수동으로 조정)를 기록하기 위해 현미경 인터페이스 소프트웨어를 사용합니다.
- 높은 전원 대물 렌즈 (일반적으로 100 배)에 현미경을 전환하고 추적 프로브의 여기 파장에 대한 적절한 필터 큐브를 선택합니다. 그리드의 첫 번째 지점으로 이동하는 단계 3.4에서 만든 점의 목록을 사용합니다.
- 우물의 바닥을 찾을 수 있도록 초점을 조정 한 후 (FOV) 몇 가지에 초점 TRAC을 포함하는보기의 필드를 찾아 이동프로브 어.
- 강도 히스토그램을 관찰하고 이미지가 포화되지 않는 것을 보장하면서 최대의 동적 범위에게 수를 제공하기 위해 노출 강도와 시간을 조정합니다.
- 프레임 당 20-30 밀리의 프레임 레이트로 비디오 시퀀스를 획득 (약 800 프레임 길이가 16 ~ 24 초는 각각의 공간 격자 점에서 획득 시간을 최소화하기위한 요구와 균형을 강력한 MSD 계산 충분한 통계 자료를 제공하는 추천) 적절한 규칙을 사용하여 저장합니다. 촬영하는 동안, 현미경 또는 테이블을 만지지 마십시오.
- 반복 그리드의 각 샘플 포인트에 대해 3.9 3.6 단계를 반복합니다.
- 반복 실험에서 각 웰에 3.10로 3.3 단계를 반복합니다.
4. 각 샘플 포인트에서 유변학 적 특성을 계산하기 위해 비디오 데이터 분석
- (아마도 다른 컴퓨터에) 분석 폴더에있는 모든 비디오 데이터를 복사합니다.
- MATLAB로 가져 오기 이미지 데이터 또는 다른 분석 소프트웨어.
NOTE : 여기에 채택 된 MATLAB 입자 추적 루틴의 설정에 관한 광범위한 설명서에서 확인할 수 있습니다 http://people.umass.edu/kilfoil . 다른 위치에서 여러 파일의 처리를 자동화하는 사용자 지정 호출 기능을 사용하는 것이 좋습니다. - 적절 프로브 중심의 위치를 식별하기위한 선택 및 거부 파라미터 (크기, 대역 통과, 등)를 결정하기 위해 비디오의 몇 프레임을 분석하여 소프트웨어를 보정. 이러한 중요한 단계에 대한 광범위한 배경은 크로커와 그리어에 의해 설명되어 있습니다.
- 자동으로 모든 비디오 프레임에 대한 각 프로브의 위치를 확인하고 궤도에이 위치를 연결하는 소프트웨어를 사용합니다.
- 등 특정 대물 렌즈, 어떤 픽셀 비닝위한 적절한 공간 교정 계수 (픽셀 당 μM)을 적용해야되고, 지연 시간의 함수로서 평균 제곱 변위 (MSD)를 계산하기 위해 궤도 정보 데이터를 사용하여 (전형적 실시메타 데이터).
- 특정 샘플 24,28,43에 대한 GSER의 적용의 한계가. 또한, 사용자가 단순히 전원 법 스케일링, 고원을 비교하여 MSD에서 직접 ECM의 특성을 해석 할 수 있습니다 고려 일반화 된 스톡스 - 아인슈타인의 관계를 이용하여 G의 *를 (계산 이질 또는 다른 매개 변수의 값, 지수.
- 반복 실험의 각 화각에 4.6을 통해 4.2 단계를 반복합니다.
- 관심의 특정 주파수에서의 점탄성 modulii과 3.4 단계에서 위치 데이터를 공동 등록 할 수 있습니다. 사용되는 현미경의 제조사에 따라,이 단계는 현미경 메타 데이터 나 위치 데이터가 수동 표로 수를 판독 지정 루틴에 의해 촉진 될 수있다.
- ECM의 공간적 레올 맵을 생성하는 3 차원 보간 함수를 사용한다.
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Representative Results
G * 복잡한 모델 종양 미세 환경 내에서 지역화 된 위치에서 (ω) 측정의 유효성을 확인하기 위해 두 개의 초기 유효성 검증 실험을 실시 하였다. 첫째, 우리는 대량 진동 전단 레오 메타의 "황금 표준"에 대한 우리의 측정을 검증하기 위해 노력했다. 우리는 1.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐의 농도 (전지 제외) 콜라겐 매트릭스의 동일한 샘플을 준비했습니다. 이러한 샘플은 ( "(이 프로토콜에 걸쳐 같은 매개 변수를 사용하여) 및 G의 결과 측정 '(ω)와 G 대량 레오 미터 (40mm 평행 판 구조를 사용하여 TA 인스트루먼트 AR-G2)으로하고 PTM으로 프로빙 된 ω ) (그림 2A)를 비교 하였다. 우수한 계약은 두 측정 사이에서 발견되었다. 둘째, 우리는 1.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐 매트릭스 및 임베디드 추적 구슬을 준비 ECM의 레올 로지 포인트의 변화를 측정하는이 프로토콜의 기능을 설정합니다. 시료를 처리 하였다빠르게 콜라겐을 소화 5 μL의 디스 파제 (그림 2B), 중앙 집중식 주입. 지역화 된 콜라겐의 분해가 발생 할 수 있도록 3 시간 동안 배양 한 후 "비디오 데이터가 주사 부위에서 다양한 거리에서 찍은 및 G의 측정 '(ω)와 G (ω)는 각각의 경우에 만들어졌다. G의 크기는 "(ω = 1 라드 / 초) 주사 부위 (ω = 1 라드 / 초) 'G의 것보다 큰 것으로 발견되었다. 주사 부위에서 증가하는 거리에서 찍은 측정은 G *의 증가 정도뿐만 아니라, G에 G의 증가 비율 ' "(도 2c)를 갖는 것으로 밝혀졌다. ~ 2mm의 높은 열화 영역의 크기는 η = (10)의 점도로 분해 콜라겐 통한 유체 역학적 반경 R의 H = 1 nm의 가진 단백질의 확산의 예측 된 거리 (디스 파제의 분자량은 32.5 kDa의 위치)와 일치 - 3 파 · 37 ° C에서 초 :
이 프로토콜에 따라 제조 된 3D 종양 모델에서 대표 데이터는. 비디오 데이터는 종양 주변의 거친 그리드 (도 3A)을 형성하는 콜라겐 지지체 내의 19 고정 위치에서 수집 하였다는도 3에 도시된다. 이 좌표 데이터는 ECM의 강성 (그림 3B)의 공간지도를 작성하는 G의 계산 된 값 '(ω)와 결합되었다. 이 공간지도 명확 콜라겐 IV, 라미닌의 V의 증착과 상관 될 수있는 일 2의 종양 회전 타원체에 바로 인접 높게 강성의 영역을 보여준다D 다른 기저막 성분은 회전 타원체 자체 17,18,44,45 또는 팽창 타원체 의한 ECM의 로컬 압축에 의해 침착.
종양의 성장과 매트릭스의 침공 이벤트 4 일 동안 관찰 하였다. 두 지역은 더 종양 주변에서 침략 세포의 증거, 또는 세포 (그림 3C)를 침입의 발음 증거 중 하나가없는 것으로 확인되었다. PTM 측정은 제 1 지역 및 제 2 ~ 4 일 이상에서 촬영했다. 하루 4로, 두 지역 (그림 3D) 사이에 (1 라드 / 초에보고) G에 상당한 차이가 '이 있었다. 지역 2, 침략 영역 (그림 3E)에서 ECM의 하루 4는 중요한 연화에 제 1 지역 및 제 2 G '및 G "의 주파수 의존 측정. 4 일 지역에 두 개의 전시 G "플롯 (그림 3E)의 점성 스케일링에 의해 분명 액체와 같은 점탄성 반응을.
차선 대표일반적인 실험 및 분석에서의 오차 결과를도 4에 나타낸다. 아마도 에러의 가장 명백한 소스 비디오 현미경이 수행 된 설치의 안정성에있다. 실험실 벤치는 변위 또는 진동의 다른 외부 소스가있는 경우, 비드 궤적 인위적 데이터 드리프트가 발생하는 경우에 영향을받을 수있다. 드리프트는 MSD가 높은 지연 시간에 극적으로 또한 'G가 발생합니다 (그림 4A) (ω)를 증가하고 G "(ω) 계산 된 값이 낮은 주파수 (그림 4B)에서 급격하게 증가하게됩니다. 드리프트는 압축 공기를 넣은 공기 쿠션 실험실 벤치의 사용을 통해 감소, 단순히 동영상이 기록되는 동안 설치를 충돌하지 않도록주의를 취함으로써 할 수 있습니다. 또한, 드리프트는 소프트웨어 루틴을 사용하여 후 처리 동안 제거 될 수있다. 이러한 루틴은 약 알려진 시간 간격으로 균일 드리프트를 제거하기에 적합하다. 이상한 드리프트 (아마 발생) 데이터 수집 동안 무대를 부딪 더 문제가있다. 따라서 샘플 데이터를 수집하는 동안 환경에서 기계적으로 격리 남아 있는지 확인하는 것이 중요합니다.
불분명 결과의 또 다른 잠재적 인 소스는 샘플 이성의 잘못된 해석에서 비롯됩니다. 샘플 공간 이질성을 관찰하고 계량화 할 수있는 능력이 실제로 PTM 26 일 (전통적인 대량 유동성 측정에 손실 뭔가)의 지적 강점 중 하나이지만, 프로브 궤도 클러스터의 부적절한 그룹화가 잘못 결론으로 이어질 수 있습니다. 소재 자체가보기의 특정 필드에 같이이 방법에 의해보고 된 ECM 강성의 변화는 본질적으로 이질적인 것을 감안할 때, 탄성 콜라겐 섬유에 의해 제한 및 확률 적으로 더 큰 물을 탐험하여 무료로하지 않습니다 몇 추적 프로브가있을 수 있습니다 모공 (그림 4C)를 가득. 이러한 "느슨한"프로브 전시 Mobility 순수 점성 환경과 거의 일치. 모든 프로브에 대한 데이터를 평균하기 때문에 점탄성 계수를 계산하기 전에, 주어진 샘플링 지역에서 몇 느슨한 프로브 (시야)를 갖는 것은 (그림 4D) 격렬하게 될 G * (ω)의 주파수 의존 그래프를 생성 할 수 있습니다.
부적 절한 소프트웨어 보정은 비디오 수집 및 분석하는 동안 오류가 발생할 수 있습니다. 영상 데이터를 수집하는 동안, 그것은 강도 히스토그램을 관찰하고 화상이 포화되지 않는 것을 보장하면서 최대 동적 범위에게 가능한주고 노광 시간을 조절하는 것이 중요하다. 분석은 각 픽셀의 강도 값을 통합하여, 각 트레이서 프로브 품위 중심 위치를 계산한다. 이미지가 포화되어있는 경우, 이러한 통합으로 인해 강도 프로파일의 '플랫 톱'부분을 덜 정확합니다. 또한 기능을 찾는 교정은 정확한 결과를 보장하는 매우 중요한 단계입니다. 선택 매개 변수의 적절한 선택은 매우 중요합니다. 이 과정은 크로커와 그리어 (42), 벵 도일 (43), 그리고 다른 사람에 의해 광범위하게 설명하고있다.
도 1. 실험 절차의 개략도. (A) 종양 상체 아가 로스 침대에 형성하고 매립 트레이서 프로브를 포함하는 3D 행렬로 전송된다. (B) 비디오 데이터는 멀리 종양 구형에서 인접 모두 잘 샘플에서 여러 지점에서 가져온 것입니다. (C) 각 비디오의 프로브 스토캐스틱 운동은 각각의 샘플 포인트에서 행렬의 로컬 유변학 적 특성을 결정하기 위해 분석된다. 이 데이터는 잘 걸쳐 ECM 강성의 공간 매핑로 컴파일됩니다.ad/51302/51302fig1highres.jpg "대상 ="_blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
측정의 그림 2. 확인. (A) G * (ω)의 구성 요소는 여기에 표시됩니다. PTM을 사용하여 G의 계산 된 값 '(ω)와 G "(ω)는 대량 레오 미터를 통해 얻은 것과 매우 유사하다. (B)의 디스 파제 5 μL은 G * (ω)에서의 공간적 변화를 측정하기 위하여 1.0 ㎎ / ㎖의 콜라겐 함유 반경 R = 8.5 mm와 웰의 중앙에 첨가 하였다. 디스 파제 주사의 사이트, 사이트에서 1.5 ㎜, 사이트에서 3mm에서 (C) 계산 G의 값 '(ω)와 G "(ω). 또한, 제어 측정이 동일 콜라겐 겔 B를 함유하는 잘 만들어진아니 디스 파제 치료와 유타. 치료 부위 G '(ω)을 (ω) "G보다 작은 근처. 겔 (ω) (ω) "G보다 큰되고 치료 사이트 G의 값 '에서 추가로 샘플링하고, G *의 크기 (ω)의 증가 때문이다. 측정 디스 파제 주사 후 2.5 시간을 촬영했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 지역 매트릭스 침략의 증상과 ECM의 레올 로지 수반의 변화를 정량화. (A) 잘 PANC-1 차원 구형을 포함는 종양 주변의 콜라겐 ECM을 통해 여러 위치에서 탐색 할됩니다. (B) 좌표 데이터는 C와 결합alculated G는 '(ω) 각 위치에 따른 공간 ECM 강성 맵을 생성한다. (C) 종양의 성장과 침략 행위 4 일 동안 관찰 하였다. 두 지역은 더 침입 세포와의 상호 작용 (지역 1, 파란색 별표) 또는 자발적으로 큰 차 다세포 구형 질량 (지구 2, 빨간 별표)로부터 분기 된 세포를 침입 무거운 상호 작용이없는 것으로 확인되었다. (D) 유변학 적 측정은 제 1 지역 및 제 2 ~ 4 일 이상에서 촬영했다. 넷째 날에 의해, 두 지역 사이의 (1 라드 / 초에보고) G에 상당한 차이가 '이 있었다. 정확하게 침략 집단의 존재와 상관 영역 (2)의 ECM, 하루 4는 중요한 연화에 지역 1과 2 (E) 주파수 의존 G의 측정 '(ω)와 G "(ω). G '(ω)와 작성 포인트 입술 채워지지로 G는 "MSD 데이터에 전원 법 적합을 사용하여 계산 (ω) 값이 표시됩니다에 각기. 4 일, 지역 두 전시에서와 같은 액체와 같은 점탄성 응답이 G "(ω) 플롯 및 G에 대한 적합 라인 '(ω)의 부재의 점성 스케일링에 의해 분명하다. 의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 이 그림.
그림 4. 데이터 표류로 인해 및 ECM의 이질성을 잘못 해석 차선의 결과에서. (A) 복합 재료에 국한 추적 조사의 MSD는 ~ τ α (전원 법 스케일링 <ΔR 2 (τ)를> 다음 0 ≤ α ≤ 1). 따라서, MSD 값은 긴 지연 시간에 고원에 접근해야한다. 샘플의 드리프트는 인위적으로이 문제, L을 제거 할 수 있습니다긴 지연 시간에 MSD 값을 점점 더 커지고 eading. (B) MSD의 긴 지연 시간 드리프트 'G의 값을 일으키는 원인이 될 것이다 (ω)와 G "(ω) 짧은 주파수에서 크게 잘못된 될 수 있습니다. 드리프트는 샘플을 기계적으로 데이터를 수집하는 동안 격리되는 것을 보장하거나 분석 중에 드리프트를 제거하기 위해 소프트웨어 루틴을 사용하여 제거하거나 또는 감소시킬 수있다. (C)에서도보기의 작은 분야에서, 프로브 궤도의 두 가지 종류가있을 수 있습니다. 이 예에서, 프로브의 대부분은 매트릭스 내에 한정하지만, 거의 '느슨한'되어있다 - 그 궤도는 훨씬 덜 강요된다. (D) 모두 제약 및 샘플 이성의 적절한 해석하지 않고 동시에 구속 프로브는 점탄성 계수의 측정을 혼동됩니다에서 MSD의 데이터를 해석하려고합니다. 하십시오 CLI이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 CK.
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Discussion
이 프로토콜에서 우리는 세로 방향으로 3D 종양 모델에서 ECM의 강성 로컬 변경 사항을 추적하기위한 강력하고 광범위하게 적용 전략을 소개합니다. 우리는이 방법은 종양의 성장과 침략 과정에서 매트릭스 리모델링에 연루 mechanosensitive 행동에 관심이 암 생물학 및 생물 물리학 자에 의해 채택 될 수 있다는 구상. 행렬 분해 반응 속도의 정확한 정량화 직접 매트릭스 리모델링에 연결되어 3D 종양 모델에서 매트릭스 메탈로, 리실 산화 효소 또는 다른 관련 생화학 종의 활동을 연구하는 사람들에게 특히 도움이 될 수 있습니다. 3D 종양 모델에 응용 프로그램이 여기에 설명을 넘어, 하나 더 시간이 지남에 따라 매트릭스의 레올 로지의 수정이 중요한 역할 (46, 47)을 담당하는 다른 질병 모델 시스템과 함께이 방법의 구현을 상상할 수 있었다. 이 방법의 유틸리티 소프트웨어 개선을 통해 향상 될을 지속적 더 자동과정을 전자 및 처리량을 증가시켜 연구를 허용한다. 이 다 잘 형식으로 사용하기 위해 동시에 많은 샘플의 실제 풍경의 세부적인 스냅 샷에서 발생합니다.
여기에 우리가 구체적으로 범위의 선형 점탄성 반응의 측정에 적합합니다 3D 종양 모델에서 수동 입자 추적 microrheology은의 구현을 설명 ~ 상업적으로 이용 가능한 세포 외 기질 제품 (소 콜라겐, EHS 종양 추출물의 일반적인 파스칼 수십 또는 상업적 나노 섬유 지지체). 확률의 관찰, 작은 프로브 변위를 정량화도 높은 개구 광학와 열 중심의 운동은, 본질적으로이 비교적 부드러운 ECM 환경의 선형 정권에 한정되어 있지만 더 엄격한 자료를 조사하고자하는 연구자들은이 프로토콜을 적용 할 수 있습니다 프로브의 48 광학 또는 자기 트래핑 49을 통해 활성 조작과 함께 사용하기에 적합합니다. 사인파전자 광학 또는 자기 핀셋 샘플 내의 단일 포인트를 프로브와 샘플의 무결성에 영향을주지 않고, 이들 기술은 아마도 더 엄격한 샘플 길이 측정을 얻기 위해 상기 프로토콜에 혼입 될 수있다.
그것은 다른 세포 생성의 힘은 다양한 시간 규모에 추적 조사의 움직임에 기여할 수 있다는 것을 관찰하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 시간과 문화의 일의 과정을 통해 발생하는 세포의 이동하는 동안, 프로브의 클러스터를 밀어 뽑아 인해 세포의 움직임과는 참으로 견인 힘 현미경 50, 51에 사용되는이 운동이 가능합니다. microrheology은 데이터를 얻기 위해 분석하는 열 구동 프로브의 움직임은 초, 명확하게 분리 할 수있는 시간 스케일의 순서에 일어난다. 그 견인력과 관련된 스트레스와 긴장의 느린 역학 레올 로지 (36)이 영상-B의 강도에 로컬 변경에 기여할 수있는 것이 사실이지만ased 방식은 샘플의 시각적 및 유동 학적 변화를 상관하는 능력에있다. 분명한 매트릭스 침략과 세포 이주 이벤트가이 마이그레이션이 발생하는 시간 동안 크기의 거의 4 주문 G의 변화 '와 상관 관계가 그림 3의 대표적인 결과의 예를 들면 다음과 같습니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 사용자가 샘플의 재생 가능한 위치를 제공하는 자동화 된 단계로 현미경에 액세스 할 수 있다고 가정합니다. 에서와 같이 가능성이 위치에서 동일한 재현성을 달성하기 어려울 것입니다하지만이 장비가없는 실험실은 여전히 같은 지점에서 반복 측정을 할 수 있도록 샘플 또는 샘플 캐리어 마크 또는 기타 시각적 단서를 사용하여 포인트 측정을 할 수 여기에 대표적인 길이 측정. z 축에 위치 이상이 대표적인 결과의 목적은, 거의 일정하게 유지되었다하십시오. 그러나, 프로토콜 기LD 또한 시료의 유동 학적 3D 맵을 생성하기 위해 Z-축을 따르는 추가적인 측정을 포함하도록 수정 될 수있다. 또한,이 방법은 레이저 스캐닝 공 촛점 또는 스캔 속도가하거나 특정 응용 프로그램에 문제가 될 수도 있고 그렇지 않을 수도 있습니다 액세스 할 수있는 상위 주파수 범위에 제한을 부과하는 것이지만 절편 3D에 다 광자 기술을 활용하기 위해 수정 될 수있다.
이 방법에서는, 상당한 시간 제약은 인큐베이터 생균을 돌려의 필요성에 의해 부과된다. 온도, 습도, CO 2 레벨 제어 할 수있는 시간이 경과 기상 관측소 인클로저없이, 영상 획득 시간을 최소화해야합니다. 심지어 적절한 장비, 데이터 수집이 모두 실제적인 한계를 가지고 있습니다 시간과 디지털 많은 양의 메모리를 차지합니다. 예를 들어, 현미경 및 본 연구에서 사용 된 카메라와 함께, 그것은 96에 하나 잘지도 할 필요가 대략 4,000 영상을 가지고 약 35 시간 걸릴 것잘보기의 필드 사이에 공간이 100X 대물 렌즈를 사용하는 판. 이러한 요인들은 현실적으로 수집 될 수있는 데이터 포인트의 수에 대한 제약을 부과. 세부 사항의 수준은, 데이터 수집, 데이터 저장 공간 및 환경 주택의 가용성 여부에 대해 가능한 시간에 의해 부과 된 실제적인 제약 때문에 될 수 있습니다.
ECM 유동성의 변화를 정량화 할 수있는 능력은 더 3D 종양 모델 17,18,52,53의 치료 반응의 정량화를위한 영상 기반의 방법과 함께 통합 될 수있다. 두 방법 모두에 채택 된 다중 아니라 3D 모델 문화 시스템은 세포 독성 반응과 기계적 환경의 변형 사이의 상관 관계를 제공하는 병렬 구현을 제안합니다. 이는 명시 적으로 기계적인 표현형을 타겟팅하거나 용량이 기존 치료제의 효과를 더욱 명료하게 전략의 개발을 촉진 할 수 있습니다. 이러한 통찰력은 직접적으로 관련 될 수조밀 한 콜라겐이 풍부한 종양의 기질을 통해 약물 전달을 향상시키기 위해 pproaches. 예를 들어,이 프로토콜의 대표적인 그림의 컨텍스트에서 중재 기질 고갈 요법, 췌장암 54 점차 중요한 치료 패러다임의 스크리닝에 사용될 수있는 다음, 체외 췌장 종양 모델 여기서 매트릭스 열화의 평가를 선보였다.
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Acknowledgments
우리는 기꺼이 (마리아 Kilfoil에서 제공하는 MATLAB 입자 추적 코드의 오픈 소스 공유 인정 http://people.umass.edu/kilfoil/ )를, 존 C. 크로커와 에릭이 제공하는 이전의 IDL 코드와 광범위한 설명서와 함께 R.의 주. 이 작품은 국립 암 연구소 (NCI / NIH), K99CA155045 및 R00CA155045 (: JPC PI)의 자금 지원에 의해 가능하게되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine type 1 collagen | BD Biosciences, San Jose, CA | 354231 | |
| PANC-1 | American Type Cell Culture, Manassas, VA | CRL1469 | or other appropriate cell type |
| Fluorescent Microspheres | Life Technologies, Carlsbad, CA | 906906 | |
| Matrigel | BD Biosciences, Bedford, MA | 354230 | |
| Agarose | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | C12H18O9 | |
| NaOH | Fisher Bioreagents, Waltham, MA | NC0480985 | |
| 96-well Imaging plates | Corning Inc., Corning, NY | 3904 | |
| DMEM | Hyclone, Waltham, MA | SH30243.01 | or appropriate cell culture media |
| Zeiss AxioObsever Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany | includes high-speed camera and imaging software | |
| MATLAB software | The Mathworks, Natick, MA |
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