Продольная Измерение внеклеточного матрикса жесткости в 3D Опухолевые модели с помощью частиц отслеживания микрореология

Summary

Микрореология частиц отслеживания может быть использован для неразрушающего количественного и пространственно карту изменений в внеклеточного матрикса механических свойств в 3D моделей опухолей.

Abstract

Механический микросреда как было показано, действовать в качестве важнейшего регулятора поведения роста опухоли и сигнализации, которая сама отремонтирован и модифицированной в рамках набора сложных, двусторонняя механочувствительных взаимодействий. В то время как развитие биологически-соответствующих 3D моделей опухолевых способствовали механистические исследования о влиянии матрицы реологических на рост опухоли, обратная задача изменения отображения в механической среде, вызванной опухолями остается сложной. Здесь мы описываем реализацию частиц отслеживания микрореологические (PTM) в сочетании с 3D моделями рака поджелудочной железы в рамках надежной и жизнеспособной подхода для продольно мониторинга физические изменения в опухоли микроокружения, на месте. Описываемая здесь методология интегрирует систему подготовки в пробирке 3D модели, внедренные в модели внеклеточного матрикса (ECM) лесов из типа I коллагена с флуоресцентной меченые зонды, равномерно распределенное для роsition-и нестационарные измерения микрореология всей образца. опухоли в искусственных условиях высевают и исследовали в параллельных условиях с использованием многоямного рентгенографические пластины. Опираясь на установленных методов, видео трассирующих движений зонда превращаются через отношение Обобщенная Стокса Эйнштейна (GSER) представить сложную частотно-зависимого модуля сдвига вязкоупругая, G * (ω). Потому что такой подход является визуализация на основе механической характеристики также отображается на больших передается освещенности пространственных областях одновременно сообщить качественные изменения в 3D размера опухоли и фенотипа. Представитель результаты, показывающие контрастные механическую ответ в субрегионов, связанных с локализованным вторжения вызванной деградации матрицы, а также калибровки системы, данные по валидации представлены. Нежелательные результаты от общих экспериментальных ошибок и устранения неисправностей этих вопросов также представлены. 96-а 3D формате культура покрытие реализованы в этом протоколе есть сonducive соотношению измерений микрореология с терапевтическими скрининга или молекулярной визуализации, чтобы получить новое понимание влияния лечения или биохимических раздражителей на механической микросреды.

Introduction

Как видно из растущего организма доказательств в литературе, что раковые клетки, как и доброкачественных эпителиальных клетках млекопитающих, очень чувствительны к механическим и биофизических свойств окружающей внеклеточного матрикса (ECM) и других компонентов микроокружения ^1-9. Элегантные механистические исследования предоставили понимание роли внеклеточной жесткости как сложной механочувствительных партнера сигнализации, которая регулирует злокачественную поведение роста и морфогенеза ^2,3,10,11. Эта работа была облегчена, в частности, развития 3D в пробирке опухолевых моделях, которые восстанавливают биологически соответствующую архитектуру ткани и могут быть выращены в каркасных материалов с перестраиваемой механики и отображаемого с помощью оптической микроскопии ^12-19. Однако, с другой стороны этого mechanoregulatory диалога между опухолью и микросреды, через который раковые клетки в свою очередь изменяет реологические свойства их окружения, остается несколькотруднее учиться. Например, во время нашествия процессов, клетки на периферии опухоли могут претерпевать эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) и увеличения экспрессии матриксных металлопротеаз (ММР), которые вызывают местный деградацию внеклеточного матрикса ^20-22, который, в свою очередь, влияет на поведение механочувствительных роста другие проксимальных опухолевые клетки. С помощью различных биохимических процессов, раковые клетки непрерывно набрать местную жесткость окружающей их среды вверх и вниз в соответствии с различными процессами в разное время. Описываемая здесь методология мотивируется необходимостью аналитических инструментов, которые сообщают местные изменения в жесткости и соответствия ЕСМ в процессе роста, которые могут быть интегрированы с 3D моделей опухоли и коррелирует продольно биохимических и фенотипических изменений, не выключая культуру.

В поисках подходящей техники для реализации в этом контексте, частица отслеживания микрореология (PTM) выступает как сильного кандидата.Этот метод, впервые первоначально Мейсон и Вайц ^23,24, использует движение трассирующих зондов, встроенных в комплексной жидкости сообщить комплексный модуль частотно-зависимого сдвига вязкоупругая, G * (ω) при длине микронных масштабах. Этот общий подход был разработан с несколькими вариациями подходят для различных применений в мягких конденсированных сред, коллоидов, биофизики и физики полимеров ^25-31. PTM имеет определенные преимущества по сравнению с другими методами, так как показания местного вязкоупругости предоставляются неразрушающего видео визуализации биохимически неактивных меченых зондов, которые включены в момент подготовки культуры и оставаться на месте в течение продолжительных периодов роста. Это в отличие от золота стандартных измерений с колебательной сдвига объемной реометре, который обязательно требует прекращения культуры и сообщает объемную макроскопического реологические свойства образца, а не точечных измерений в рамках комплексной 3D опухоли microenvirютере. Действительно ряд исследований показано полезность интерпретации измерения движений трассирующими зонда в или вокруг раковых или не раковых клеток для измерения деформации, связанные с клеточной миграции ^32, механическим нагрузкам, вызванной расширяющейся сфероида ^33, внутриклеточного реологии ^34,35, и для сопоставления механических напряжений и деформаций в инженерных тканей ³⁶ и соотношение между размером пор и скорости вторжения ^37. Другие методы, подходящие для микрореологические, такие как атомно-силовой микроскопии (АСМ) может быть реализован, но, прежде всего, для зондирования точки на поверхности образца, а также может представлять проблемы стерильности культуры, которые усложняют продольные измерений ^38.

Здесь мы описываем комплексный протокол, охватывающий методы для роста 3D опухолевых сфероидов, пригодных для передачи в ECM со встроенными флуоресцентных зондов для видео частиц отслеживания и анализа методов надежно отображения пространственныеизменения в микрореологические с течением времени в культуре. В текущей реализации, модели 3D опухолевые выращивают в многоямного формате с целью к включению измерений микрореология с другими традиционными анализами (например, цитотоксичность), которые этот формат способствует. В этом представительного иллюстрации данной методики мы, в культуре пробирке 3D сфероидов с использованием PANC-1 клетки, установлено, линия поджелудочной железы раковые клетки, как известно, образуют сфероидов ^39, но все измерения, описанные здесь, могут широко применяться для изучения солидных опухолей с использованием различных клеточных линий подходит для 3D культуры. Поскольку этот метод по своей сути визуализации на основе он идеально подходит для совместного регистрации микрореология данных высокого разрешения с большими передается-световых полей зрения, которые сообщают изменения в клеточного роста, миграции и фенотипа. Осуществление PTM интегрирована с передаваемой световой микроскопии таким образом предполагает, воспроизводимое позиционирование микроскопа стадии Whич как правило, доступны на моторизованных коммерческий Widefield эпифлуоресцентной биологических микроскопов. Протокол, разработанный ниже, могут быть реализованы с любым разумно оборудованный автоматизированный флуоресценции биологического микроскопа. Само собой, это данные с интенсивным методом, который требует получения гигабайт цифровых данных видео микроскопии для автономной обработки.

В следующем протоколе Протокол 1 относится к первоначальной подготовки опухолевых сфероидов, который описанных здесь с помощью наложения на агарозе но могут быть замещены различными другими способами, такими как висит капли ⁴⁰ или ⁴¹ поворотного культуры методов. Протокол 2 описывает процесс встраивания сфероидов в коллагеновой строительные леса, хотя в качестве альтернативы, в пробирке 3D опухоли могут быть выращены инкапсуляции или вложения ресуспендировали клеток в ECM ^12,15, а не отдельных предварительно сформированных неадгезивных сфероидов. Последующие протоколы описывают процедуры для Øbtaining временным разрешением измерения микрореология путем приобретения и обработки данных видео микроскопии, соответственно. Обработка данных описывается с помощью MATLAB, используя процедуры с открытым исходным кодом для PTM построен на алгоритмах первоначально описанных Крокер и Грира ^42, который также широко развитой для различных программных платформ (см. http://www.physics.emory.edu/ ~ недели / IDL /).

Protocol

1. Культивирование Опухолевые Сфероиды

1. Смешайте 10 мл сорта культуры клеток воды с 0,1 г агарозы, чтобы получить 1%-ный раствор агарозы.
2. Тепло раствор агарозы в свыше 70 ° С (примерно 14 сек в стандартном микроволновой печи или с помощью нагревательной плитке) до аликвоты 40 мкл раствора агарозы в скважину на 96-луночный планшет.
3. Инкубируют планшет при 37 ° С в течение по меньшей мере 1 ч при уборке клеток с использованием стандартных методик.
4. С помощью гемоцитометра, чтобы определить концентрацию клеток в суспензии.
5. Развести клеточной суспензии до 1000 клеток / мл и добавить 100 мкл этого разведения к колодцу, содержащий вылечить агарозном кровать.
6. Поместите образец на шейкере в течение ночи в инкубатор при 37 ° 5% СО ₂ С и.
7. Снять образец из шейкере и добавить 100 мкл клеточной культуры.
8. Выдержите сфероидов пока желаемый диаметр не будет достигнута. Например, после 9 дней, зрheroid будет примерно 450 мкм в диаметре. В течение этого времени свежую среду роста могут быть добавлены к лункам, но стремление следует избегать, поскольку это приведет к удалению сфероида.

2. Подготовка 3D опухолевых сфероидов Embedded в ECM

1. Подготовить рабочее место с необходимым материалов внутри ламинаре.
2. Подготовка разбавленной смеси карбоксилат-модифицированный 1 мкм диаметра люминесцентных меченых зондов, добавив 2 части акций зондов (2% твердых частиц) до 25 частей стерильной водой.
3. Удалить бутылку 3,1 мг / мл бычьего коллагена из холодильника и положите его на лед.
4. Аликвоты 125 мкл коллагена в пустую 2 мл флакон.
5. Добавить 50 мкл разбавленного раствора трассировщик зонда во флакон, содержащий коллаген и вихрь кратко распределить зондов.
6. Добавить 235 мкл соответствующих среды для культивирования клеток, содержащей фенол красный (который станет желтой) для общего объема 410 мл и вихрь кратко до удаления 205 мл (половина от общего объема) и размещение его в новом 2 мл флаконе. Флакон 1 будет содержать сфероид опухоли и колба 2 будет контроль смесь.
7. Добавить ~ 2 мкл 1 М NaOH, чтобы флакон 1 для доведения раствора обратно в нейтральном рН (питательные среды, содержащие фенол красный должен вернуться в красный цвет). Заметим, что это приведет к тому, смесь начать лечение, если оно не держат на льду. Vortex кратко перемешать, затем немедленно вернуться в ледяной стойки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: сфероид едва виден невооруженным глазом после 9 дней культуры и ее удаления из агарозном кровати является деликатной задачей. Использование микроскопом рассечение может быть полезным для некоторых пользователей. Поддержание целостности сфероида во время передачи имеет первостепенное значение.
8. Использование пипетки с широким горлом, аккуратно удалить 40 мкл СМИ из колодца, содержащий сфероид опухоли. Сохраните это 40 мкл при проведении следующий шаг.
9. Проверьте хорошо, чтобы убедиться, сфероидудаляли в предыдущем шаге. Если бы это было, добавьте 40 мкл, содержащие сфероид чтобы флакон 1. Если нет, то поместите 40 мкл обратно в колодец и повторите предыдущий шаг.
10. Аккуратно перемешать флакон 1 (не рискуете вихревание, это может привести к повреждению сфероид) перед передачей смесь в 60 мкл порциями на три отдельных лунки 96-луночного планшета. Проверьте каждую лунку с помощью микроскопа после добавления смесь определить, какие хорошо содержит сфероид.
11. Добавить ~ 2 мкл 1 М NaOH и 40 мкл клеточной культуры в флакон 2 и вихрь перед aliquotting 60 мкл этой смеси в пустой хорошо в 96-луночный планшет и маркировки в качестве контроля.
12. Место пластины в 37 ° С инкубатор лечить, по крайней мере 1 часа.

3. Построить сетку из точек выборки и снять видео в каждой точке

1. Передача образца пластину из инкубатора, чтобы столик микроскопа. Разрешить 10 мин для образца, чтобы equilibrate с комнатной температурой, если нагретый этап не доступен.
2. Соблюдайте образца с малой мощности объективов, чтобы убедиться, что это нетронутыми и готовы для работы с изображениями. Определить положение опухоли в скважине.
3. Решите, сколько точек выборки взять. Как правило, 20 точки отбора проб в каждой лунке, распределенные в концентрических колец вокруг сфероида будет производить адекватно подробные результаты.
4. Перемещение на сцену, чтобы каждого нужное положение и использовать микроскоп взаимодействия программного обеспечения для записи х и у координаты (или запись координат вручную, если взаимодействие программного обеспечения недоступна).
5. Переключите микроскоп для высокой мощности объектива (обычно 100X), и выберите соответствующий куб фильтра для длины волны возбуждения из трассирующих зондов. Используйте список точек, созданных в шаге 3.4, чтобы перейти к первой точке в сетке.
6. Настройте фокус найти дно колодца, а затем перейти до найти поле зрения (FOV), содержащий несколько в фокусе ПРОФэ зонды.
7. Соблюдайте гистограмму интенсивности и регулировать интенсивность и время экспозиции, чтобы дать наибольшее динамический диапазон можно, обеспечивая при этом изображение не становится насыщенным.
8. Получить видеоряд с частотой кадров 20-30 мс на кадр (примерно 800 кадров или 16-24 сек в длину рекомендуется предоставить достаточные статистики для надежной расчета MSD сбалансированы с потребностью в минимизации времени захвата в каждой точке пространства сетки) и сохранить с соответствующим конвенции. Во время записи, не прикасайтесь к микроскоп или стол.
9. Повторите шаги 3,6 до 3,9 для каждой точки образца в сетке.
10. Повторите этапы 3,3 до 3,10 для каждой лунки в эксперименте.

4. Анализ видеоданных вычислить реологические свойства на каждый образец Пойнт

1. Скопируйте все видеоданные в папку анализа (возможно на другом компьютере).
2. Данные изображения импортировать в MATLAB или другое программное обеспечение анализа.
   НЕТTE: Обширная документация относительно множества MATLAB процедур отслеживания частиц, принятых здесь можно ознакомиться на http://people.umass.edu/kilfoil . Использование пользовательских вызывающей функции для автоматизации обработки нескольких файлов в различных положениях рекомендуется.
3. Калибровка программного обеспечения на основе анализа нескольких кадров видео, чтобы надлежащим образом определить отбора и отторжения параметры (размер, полосовых, и т.д.) для выявления позиции центра зонд. Обширная фон для этих важных шагов описывается Крокер и Грира.
4. Используйте программное обеспечение для автоматического определения каждую позицию зонда для всех видеокадров, а затем связать эти позиции в траектории.
5. Использование данных траектории, чтобы вычислить средний квадрат смещения (MSD) в зависимости от времени задержки, будучи уверенным, чтобы применить соответствующий коэффициент пространственной калибровки (мкм на пиксель) для конкретного объектива, любой пиксель биннинга и т.д. (как правило, осуществляетсяв мета-данных).
6. Рассчитать G * (используя обобщенный Стокса-Эйнштейна отношение приняты во внимание пределы применимости GSER для конкретного образца ^24,28,43. Кроме того, пользователи могут пожелать, чтобы интерпретировать свойства ECM непосредственно из MSD просто сравнивая степенной закон масштабирование, плато ценности, индексы неоднородности или других параметров.
7. Повторите шаги 4,2 через 4,6 для каждого поля зрения в эксперименте.
8. Со-зарегистрируйтесь данные о положении с шага 3.4 с вязкоупругих удлинении на определенной частоте интересов. В зависимости от производителя микроскопа, используемого, этот шаг может быть облегчено с помощью настраиваемой рутины, которая гласит метаданные микроскопа или положение данных, можно рассматривать вручную.
9. Используйте 3D-функции интерполяции, чтобы генерировать пространственные реологических карту ЕСМ.

Representative Results

Чтобы убедиться в справедливости G * (ω) измерений в локализованных должности в сложной опухоли модель микросреды, были проведены два начальных проверочные эксперименты. Во-первых, мы стремились утвердить наши измерения против "золотого стандарта" объемной колебательной реометрии сдвига. Мы подготовили одинаковых образца коллагеновой матрице (без клеток) при концентрации 1,0 мг / мл коллагена. Эти образцы были исследованы с объемной реометра (TA Instruments AR-G2, с использованием 40 мм параллельной геометрии пластины) и ПТМ (с теми же параметрами, как в данном протоколе) и полученные в результате измерения G '(ω) и G "(ω ) были сравнены (рис. 2а). Отлично соглашение было найдено между двумя измерениями. Во-вторых, установить способность этого протокола для измерения точки изменения в ECM реологии мы подготовили 1,0 мг / мл матрицу коллагена и внедренные трассирующими бусы. Образец затем обрабатываютцентрализованная инъекции 5 мкл диспазы (рис. 2В), который быстро переваривает коллагена. После инкубации в течение 3 часов, чтобы позволить локализованные коллаген пищеварение происходит, видеоданные было принято на различном расстоянии от места инъекции, и измерения G '(ω) и G "(ω) были сделаны в каждом конкретном случае. Величина G "(ω = 1 рад / с) было установлено, что больше, чем у G '(ω = 1 рад / с) в месте инъекции. Измерения, проведенные при увеличении расстояния от места инъекции было установлено, что все большее величину G *, а также все большее отношение G 'в G "(рис. 2в). Размер высоко деградированных области ~ 2 мм соответствует оценкам расстоянии диффузии белка с гидродинамический радиус R _H = 1 нм (молекулярная масса диспазы является 32,5 кДа) через переваренной коллагена с вязкостью η = 10 ^{- 3} Па · сек при 37 ° С: . Поэтому результаты согласуются с ожидаемым смягчением матрицы вблизи места инъекции, и продемонстрировать нашу способность делать точные, локализованные измерения матрицы реологии.

Типичные данные из 3D модели опухоли, полученного в соответствии с этим протоколом показано на рисунке 3. Видеоданные были собраны в 19 фиксированных местах в пределах коллагена строительных лесов, образуя грубую сетку вокруг опухоли (фиг. 3A). Это данные координат сочеталась с рассчитанными значениями G '(ω), чтобы создать пространственную карту ECM жесткости (рис. 3В). Эта пространственная карта ясно показывает зону повышенной жесткости сразу ближний к сфероида опухоли на 2-й день, что может быть связано с отложением коллагена IV, ламинин V апд другие компоненты базальной мембраны хранение самим сфероида ^17,18,44,45 или местного сжатия ЕСМ расширяющейся сфероида.

Рост опухоли и матричные вторжения события отслеживались в течение 4 дней. Два региона были определены как не имеющие ни никаких доказательств инвазивных клеток на периферии опухоли, или выраженный доказательства вторжения клетки (рис. 3C). Измерения PTM были приняты на областях 1 и 2 более 4 дней. Днем 4, была значительная разница в G '(сообщается на 1 рад / с) между двумя регионами (рис. 3D). Частотно-зависимые измерения G 'и G "для областей 1 и 2 на 4-й день шоу значительного смягчения ЕСМ в области 2, инвазивного регионе (рис. 3Е). На 4-й день регионе два экспонаты ответ вязкоупругую жидкости, как, видно по вязкой масштабирования сюжета G "(Рисунок 3E).

Представитель неоптимальнойрезультаты обычной экспериментальных и анализа ошибок показаны на рисунке 4. Возможно, наиболее очевидным источником ошибок заключается в стабильности установки, где осуществляется видеомикроскопия. Если лаборатория скамейка смещается или если есть другие внешние источником вибрации, шарик траектории могут быть искусственно влияние, что приводит к дрейфу в данных. Дрейф вызывает MSD, чтобы резко увеличить в разы высокой отставание (рис. 4а), который также вызывает G '(ω) и G "(ω) расчетные значения резко увеличить на низких частотах (рис. 4б). Дрейф может быть уменьшена за счет использования пневматического, Надувное лабораторном столе, и просто заботясь, чтобы не врезаться установку в то время как видео записывается. Кроме того, дрейф может быть удалена во время последующей обработки с помощью программного обеспечения подпрограммы. Эти процедуры являются подходящими для удаления дрейф, который является приблизительно одинаковым по известным временного интервала. Самопроизвольное дрейф (возможно вызванонатыкаясь на сцену во время сбора данных) является более проблематичным. Поэтому важно, чтобы убедиться, что образец остается механически изолированы от окружающей среды во время сбора данных.

Другим потенциальным источником неясными результатами происходит от неправильного толкования образца неоднородности. Хотя способность наблюдать и количественно пространственной неоднородности в образце действительно является одним из отмеченных преимуществ PTM ²⁶ (и то, что теряется в традиционных измерений объемной реологических), неправильное группировка скоплений зонда траекторий может привести к неправильным выводам. Учитывая, что изменения в ECM жесткости, представленные этой методологии по своей природе неоднородны, как и сам материал, в той или иной поля зрения, не может быть несколько трассирующие зонды, которые не упруго, ограниченные коллагеновых волокон и, таким образом свободные к стохастически исследовать большую воду заполненные поры (рис. 4в). Эти "свободные" зонды экспонат мobility примерно соответствует чисто вязкой среде. Поскольку данных для всех зондов усредняется до вязкоупругих модулей рассчитываются, имея несколько свободных зондов в данной выборки области (поле зрения) может производить зависимые от частоты участки G * (ω), которые изменяются дико (рис. 4D).

Неправильное калибровки программного обеспечения может привести к ошибкам во время сбора видео и анализа. Во время сбора данных видео, важно наблюдать гистограмму интенсивности и настроить время экспозиции, чтобы дать наибольшее динамический диапазон можно, обеспечивая при этом изображение не становится насыщенным. Анализ вычисляет усовершенствованный центр позиции для каждого индикаторного зонда путем интегрирования значение интенсивности каждого пикселя. Если изображение является насыщенным, эта интеграция будет менее точным из-за разделе 'плоским верхом "профиля интенсивности. Кроме того, калибровка функция находка является чрезвычайно важным шагом в обеспечении точных результатов. Правильный выбор параметров выбора имеет первостепенное значение. Этот процесс был подробно описан Крокер и Гриер ^42, Савин и Дойл ^43, и другие.

Рисунок 1. Схема экспериментальной процедуры. (A) Опухолевые сфероиды формируются на агарозных кровати, и затем переносили в 3D-матрицы, содержащей встроенные трассирующие зондов. (Б) данные видео взято в нескольких точках внутри образца хорошо, как рядом с и далеко от сфероида опухоли. (C) стохастическое движение зондов в каждом видео анализируется с целью определения локальных реологических свойств матрицы в каждой точке выборки. Эти данные собраны в пространственной отображения ECM жесткости по всей скважине.ad/51302/51302fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. Проверка измерений. (А) Компоненты G * (ω) показаны здесь. Расчетные значения G '(ω) и G "(ω) с использованием PTM очень похожи на те, получены с помощью объемной реометре. (В) 5 мкл диспазы был добавлен в центре хорошо с радиусом г = 8,5 мм, содержащего 1,0 мг / мл коллагена для измерения пространственных изменений в G * (ω). (C) Расчетные значения G '(ω) и G "(ω) на месте инъекции диспаза, 1,5 мм с сайта, и 3 мм от сайта. Кроме того, контрольное измерение было сделано в скважине, содержащий ту же коллагеновый гель бут с отсутствием лечения диспаза. Рядом с сайта лечение G '(ω) меньше, чем G "(ω). Как гель пробы дальше от лечения сайте приведены значения G '(ω) стать больше, чем G "(ω), а величина G * (ω) возрастает. Измерения проводились 2,5 часа после диспаза инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Количественная изменения в ECM реологических одновременно с наступлением местной матрицы вторжения. (А) также содержащий PANC-1 3D сфероид будет тестироваться в нескольких местах по всему коллагена ECM, окружающей опухоль. (B) координировать данные в сочетании с Calculated G '(ω) для каждого места для получения пространственного ECM жесткость карту. (C) Рост опухоли и поведение вторжение наблюдали в течение 4 дней. Два региона были определены как не имеющие либо не взаимодействие с вторжения клеток (регион 1, синий звездочка) или тяжелую взаимодействие с вторжения клетки, которые спонтанно разветвленные из большого первичного многоклеточного массы сфероида (регион 2, красной звездочкой). Измерения (D) Реологические были приняты на областях 1 и 2 более 4 дней. На четвертый день, была значительная разница в G '(сообщается на 1 рад / с) между двумя регионами. (E) зависит от частоты измерения G '(ω) и G "(ω) для областей 1 и 2 на 4-й день шоу значительного смягчения ЕСМ в области 2, точно коррелирует с наличием инвазивных населения. G '(ω) и G "(ω) значения, рассчитанные по степенному закону подгонку к данным MSD показаны как с начинкой и без точки разрешениемpectively. На 4-й день, области двух экспонатов жидкоподобной вязкоупругая ответ как видно по вязкой масштабирования G "(ω) участка и отсутствие подходящую линию для G '(ω). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этот показатель.

Рисунок 4. Данных из суб-оптимальных результатов из-за дрейфа и неправильной интерпретации ECM неоднородности. (А) СКО индикаторного зонда, заключенного в сложной материала следует степенному закону масштабирования <Δr ² (τ)> ~ ^τ α (0 ≤ α ≤ 1). Соответственно, значения MSD должны подходить плато при больших временах запаздывания. Дрейф в образце может искусственно устранить эту проблему, лeading к эскалации значения MSD при больших временах запаздывания. (B) длиной отставание время дрейфа в MSD вызовет значения G '(ω) и G "(ω), чтобы стать значительно ошибочным на коротких частотах. Дрейф может быть устранена или уменьшена либо путем обеспечения того, образец механически изолирован во время сбора данных или с помощью программных процедур, чтобы удалить дрейф в процессе анализа. (С) Даже на небольшом поле зрения, два различных сорта зонда траекторий может присутствовать. В этом примере, большинство зондов приурочены в матрице, но немногие из них "свободные" - их траектории гораздо меньше ограничений. (D) Попытка интерпретировать MSD данные и ограничены и безусловной зонды в то же время без правильной интерпретации образца неоднородности будет путать измерения вязкоупругих модулей. Пожалуйста климатобы здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Discussion

В этом протоколе введем надежную и широко применимый стратегию продольно отслеживания локальные изменения в ECM жесткости в моделях 3D опухолей. Мы предполагаем, что эта методология может быть принят рака биологов и биофизиков, заинтересованных в механочувствительных поведения, причастных к матричной ремоделирования во время роста опухоли и вторжения процессов. Точное количественное определение матричных деградации кинетики может быть особенно ценным для тех, кто изучает деятельность матричных металлопротеаз, лизилоксидазы или других соответствующих биохимических видов в 3D моделей опухолевых, которые непосредственно связаны с матрицей реконструкции. За применение к моделям 3D опухолевых описано здесь, можно было бы дополнительно представить себе реализацию этого подхода в сочетании с другими модельными болезнь систем, в которых модификация матрицы реологических с течением времени играет важную роль ^46,47. Полезность этого метода продолжает быть повышена за счет улучшения программного обеспечения, что дальнейшее автоматэлектронной процесс и учитывать, что исследований пропускной. Это приведет к более детальных снимков физического ландшафта многих образцов, одновременно, для использования в многоканальных форматов также.

Здесь мы специально описывать ход осуществления пассивного частиц отслеживания микрореологические в моделях 3D опухолевых, которая хорошо подходит для измерения линейного отклика вязкоупругой в диапазоне ~ десятки Pascal типичные коммерчески доступных внеклеточного матрикса продукции (бычий коллаген, EHS-опухолевые экстракты или коммерческие леса нановолокон). Наблюдение стохастических, термически приводом движения, даже при высоких оптики числовой апертурой количественно малые смещения зонда, в своей основе ограничена линейном режиме этих относительно мягких условиях ECM, но следователи, желающие исследовать более жесткие материалы могут быть в состоянии адаптировать этот протокол для использования с активными манипуляций через оптический ⁴⁸ или захвата магнитного ⁴⁹ зондов. Sincе оптические или магнитные пинцет зонд одну точку в образце и не влияют на целостность образца, эти методы могли бы быть включены в приведенном выше протоколе, чтобы получить продольные измерения более жестких образцов.

Важно заметить, что другие мобильные генерируется силы могут также способствовать трассирующих движений зонда в различных временных масштабах. Например, во время миграции клеток, происходящих в течение часов и дней в культуре, кластеры зондов будет толкают и тянут за счет движений клеток, и это действительно это движение, которое используется в тяги силовой микроскопии ^50,51. В термически приводом движения зонда которые анализируются для получения данных микрореология состоится порядка секунд, четко сепарабельном масштабе времени. В то время как верно и то, что более медленные динамика напряжений и деформаций, связанных с тяговых сил может способствовать локальных изменений в реологии ^36, в силу этого изображения-бASED подход заключается в умение соотносить визуальные и реологические изменения в образце. Например, в представительных результатов на рисунке 3, очевидно событие матрица вторжение и миграция клеток коррелирует с изменением G 'почти на четыре порядка во время эта миграция происходит.

Протокол, описанный здесь предполагается, что пользователи имеют доступ к микроскопом с моторизованным этапе, что обеспечивает воспроизводимое позиционирование образца. Labs, которые не имеют этой аппаратуры может еще сделать измерения точки с помощью знаков или других визуальных подсказок в носителя образца или образца, позволяя повторные измерения в одной точке, хотя это, вероятно, будет трудно добиться того же воспроизводимость в позиционировании, как показано на представительные продольные измерения здесь. Для целей этих представительных результатов выше, позиционирующие на оси держали примерно постоянным. Однако протокол кулоновскогол.д. также быть изменен для включения дополнительных измерений вдоль оси, чтобы создать 3D-реологические карту образца. Метод также может быть изменен, чтобы использовать сканирующий лазерной конфокальной или многофотонные методы для 3D секционирования хотя скорости сканирования будет налагать ограничение на верхних пределов частот, доступных, что может или не может быть проблематичным для данного приложения.

В этом методе, значительное время ограничение накладывается по необходимости возврата живых клеток в инкубатор. Без корпуса метеостанции покадровой контролировать температуры, влажности и CO ₂ уровнях, время захвата изображений должны быть сведены к минимуму. Даже имея необходимое оборудование, сбор данных занимает большое количество времени и цифровой памяти, которые являются одновременно предметом практических ограничений. Например, с микроскопом и фотокамеры, использованные в исследовании, это займет примерно 35 час, чтобы принять около 4000 видео необходимо сопоставить одну скважину на 96Лунками с помощью объектива 100X без пробела между полями зрения. Эти факторы накладывают ограничения на количество точек данных, которые реально могут быть собраны. Уровень детализации, следовательно, подлежат практических ограничений, налагаемых времени, отведенного для сбора данных, места для хранения данных и наличия экологической жилья.

Возможность количественного изменения в ECM реологии можно было бы дополнительно интегрированы наряду с изображениями на основе методов количественной оценки терапевтического ответа в 3D моделях опухолей ^17,18,52,53. Многоскважинных 3D модель системы культуры, принятой в обоих методов предполагает параллельную реализацию, обеспечивая связь между цитотоксической реакции и модификации механической среде. Это может способствовать развитию дальнейших стратегий, которые явно нацелены механическую фенотип или выяснения воздействия существующих терапии в этом качестве. Такое понимание может иметь непосредственное отношение кpproaches для повышения доставки лекарств через густой богатой коллагеном опухоли стромы. Например, в контексте представительства иллюстрации этого протокола представлена ​​здесь с в пробирке поджелудочной моделях опухолей, оценку деградации матрицы следующие мероприятия могут быть использованы для скрининга схемы истощения стромальных, все более важную терапевтическую парадигму для рака поджелудочной железы ^54.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine type 1 collagen	BD Biosciences, San Jose, CA	354231
PANC-1	American Type Cell Culture, Manassas, VA	CRL1469	or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres	Life Technologies, Carlsbad, CA	906906
Matrigel	BD Biosciences, Bedford, MA	354230
Agarose	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	C12H18O9
NaOH	Fisher Bioreagents, Waltham, MA	NC0480985
96-well Imaging plates	Corning Inc., Corning, NY	3904
DMEM	Hyclone, Waltham, MA	SH30243.01	or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope	Zeiss, Oberkochen, Germany		includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software	The Mathworks, Natick, MA