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Bioengineering

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

Published: June 10, 2014 doi: 10.3791/51302
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Physics, University of Massachusetts Boston
* These authors contributed equally

Summary

microrhéologie de traces de particules peut être utilisé pour quantifier de manière non destructive et spatialement cartographier les changements dans les propriétés mécaniques matrice extracellulaire dans des modèles de tumeurs 3D.

Abstract

Le micro-mécanique a été montré pour agir comme un régulateur essentiel du comportement de la croissance tumorale et de signalisation, qui est elle-même transformée et modifiée dans le cadre d'un ensemble d'interactions, dans les deux sens mécanosensibles complexes. Alors que le développement de modèles de tumeurs 3D biologiquement pertinentes ont facilité études mécanistiques sur l'impact de la matrice rhéologie sur la croissance de la tumeur, le problème inverse de l'évolution de la cartographie de l'environnement mécanique induite par des tumeurs reste difficile. Ici, nous décrivons la mise en œuvre de microrhéologie de traces de particules (PTM) en conjonction avec des modèles 3D de cancer du pancréas dans le cadre d'une approche robuste et viable pour le suivi longitudinal des changements physiques dans le microenvironnement de la tumeur, in situ. La méthodologie décrite ici intègre un système de préparation de modèles in vitro 3D incorporés dans un modèle de matrice extracellulaire (ECM) de l'échafaudage de collagène de type I avec des sondes marquées par fluorescence répartis uniformément pour po-sition et des mesures de temps-dépendante Microrhéologie à travers l'échantillon. tumeurs in vitro sont étalées et sondés dans des conditions parallèles en utilisant des plaques d'imagerie multi-puits. S'appuyant sur ​​des méthodes établies, les vidéos des traceurs mouvements de la sonde sont transformés par la Relation généralisé Stokes Einstein (TBS) pour signaler le complexe viscoélastique module de cisaillement dépendant de la fréquence, G * (ω). Parce que cette approche est basée imagerie, caractérisation mécanique est également mappé sur de grands champs spatiaux transmis-lumière de signaler simultanément des changements qualitatifs dans la taille et le phénotype tumoral 3D. Les résultats représentatifs montrant contraste réponse mécanique dans les sous-régions associées à une dégradation locale de la matrice induite invasion ainsi que le calibrage du système, les données de validation sont présentés. Résultats indésirables de erreurs expérimentales communes et le dépannage de ces questions sont également présentés. Le format de la culture placage 3D 96 puits mis en œuvre dans ce protocole est conducive de corrélation des mesures de Microrhéologie avec des essais de criblage thérapeutiques ou d'imagerie moléculaire à acquérir de nouvelles connaissances dans l'impact des traitements ou à des stimuli biochimiques sur le microenvironnement mécanique.

Introduction

Il est clair à partir d'un nombre croissant de preuves dans la littérature que les cellules cancéreuses, comme les cellules épithéliales de mammifères non malignes, sont très sensibles aux propriétés mécaniques et biophysiques de la matrice extracellulaire environnante (ECM) et d'autres composants de microenvironnement 1-9. Études mécanistiques élégantes ont donné un aperçu du rôle de la rigidité extracellulaire en tant que partenaire de signalisation mécano complexe qui régit le comportement de la tumeur maligne et la morphogenèse 2,3,10,11. Ce travail a été facilité en particulier par le développement de la 3D dans des modèles de tumeurs in vitro qui restaurent biologiquement architecture tissulaire pertinents et peuvent être cultivées dans des matériaux d'échafaudage mécanique accordables et imagés par microscopie optique 12-19. Cependant, de l'autre côté de cette boîte de dialogue entre mechanoregulatory microenvironnement tumoral et, à travers laquelle les cellules cancéreuses, à son tour modifier la rhéologie de leur environnement, reste assezplus difficile à étudier. Par exemple, au cours des processus d'invasion, les cellules à la périphérie d'une tumeur peut subir une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et augmenter l'expression de métalloprotéases matricielles (MMP) qui provoquent une dégradation locale de l'ECM 20 à 22, qui à son tour, influence le comportement de croissance mécanosensible d' d'autres cellules tumorales proximales. Grâce à une variété de processus biochimiques, les cellules cancéreuses composer continuellement la rigidité locale de son environnement de haut en bas en fonction de différents processus à des moments différents. La méthode décrite ici est motivé par le besoin d'outils d'analyse qui rendent compte des changements locaux dans la rigidité et la conformité de l'ECM lors de la croissance, qui peuvent être intégrés aux modèles tumoraux 3D et corrélés longitudinalement par des changements biochimiques et phénotypiques sans mettre fin à la culture.

A la recherche d'une technique appropriée pour mettre en œuvre dans ce contexte, microrhéologie particules de suivi (PTM) apparaît comme un candidat sérieux.Ce procédé, a lancé à l'origine par Mason et 23,24 Weitz, utilise le mouvement de sondes de traceurs incorporés dans un fluide complexe pour signaler le module complexe dépendant de la fréquence viscoélastique de cisaillement, G * (ω) à des échelles de longueur micron. Cette approche générale a été développé avec de multiples variantes adaptées pour différentes applications dans la matière, colloïdes, biophysique molle condensée et la physique des polymères 25-31. PTM a certains avantages par rapport à d'autres méthodes, comme les lectures de viscoélasticité locale sont fournies par l'imagerie vidéo non destructif de sondes de traceurs biochimiques inactifs qui sont incorporés au moment de la préparation de la culture et restent en place pendant de longues périodes de croissance. Ceci est en contraste avec les mesures de l'étalon-or avec un rhéomètre à cisaillement oscillatoire vrac, ce qui nécessite obligatoirement la fin de la culture et des rapports de la rhéologie macroscopique de l'échantillon en vrac plutôt que des mesures ponctuelles sein de la tumeur microenvir 3D complexeronnement. En effet, un certain nombre d'études ont montré l'utilité de l'interprétation des mesures de mouvements de la sonde de traceur dans ou autour de cellules cancéreuses ou non-cancéreuses de mesurer des déformations associées à la migration des cellules 32, le stress mécanique induit par un sphéroïde expansion 33, rhéologie intracellulaire 34,35, et mapper les contraintes mécaniques et les déformations dans les tissus par génie 36, et la relation entre la taille des pores et la vitesse d'invasion 37. D'autres techniques appropriées pour microrhéologie, telles que la microscopie à force atomique (AFM) peuvent être mises en œuvre, mais surtout pour les points de palpage à la surface de l'échantillon et peuvent également poser des problèmes de stérilité culture qui compliquent les mesures longitudinales 38.

Ici, nous décrivons un protocole complet qui englobe les méthodes de croissance des sphéroïdes tumoraux 3D appropriés pour le transfert dans ECM avec des sondes fluorescentes intégrés pour la vidéo particules de suivi et d'analyse pour la cartographie fiable spatialechangements dans microrhéologie au fil du temps dans la culture. Dans la présente application, les modèles de tumeurs 3D sont cultivées en format multi-puits en vue de leur incorporation des mesures de Microrhéologie avec d'autres tests traditionnels (par exemple, cytotoxicité) qui ce format est propice à la. Dans cette illustration représentative de cette méthodologie nous culture in vitro sphéroïdes 3D en utilisant des cellules Panc-1, une lignée cellulaire de cancer pancréatique établi connus pour former des sphéroïdes 39, mais toutes les mesures décrites ici sont largement applicables à l'étude des tumeurs solides en utilisant une variété de lignées cellulaires adaptés à la culture 3D. Fondés sur l'imagerie parce que cette méthode est intrinsèquement il est idéal pour les co-enregistrement des données de Microrhéologie haute résolution avec de grands champs de diascopie de vue qui signalent des changements dans la croissance cellulaire, la migration et le phénotype. La mise en œuvre de PTM intégré à la microscopie lumière transmise de cette manière suppose positionnement reproductible des wh stade de microscopeich est généralement disponible sur grand champ épifluorescence commerciale microscopes biologiques motorisés. Le protocole développé ci-dessous peut être mis en oeuvre avec n'importe quel fluorescence automatisé microscope biologique raisonnablement équipé. Il s'agit d'une méthode intensive de données en soi, ce qui nécessite l'acquisition de gigaoctets de données numériques de microscopie vidéo pour le traitement hors ligne.

Dans le protocole suivant, le protocole 1 se rapporte à la préparation initiale des sphéroïdes de tumeur qui est décrite ici en utilisant superposition sur agarose, mais pourrait être substitués par une variété d'autres méthodes telles que la goutte suspendue 40, ou culture rotatif 41 techniques. Protocole 2 décrit le processus d'intégration des sphéroïdes dans un échafaudage de collagène mais alternativement, in vitro tumeurs en 3D peuvent être cultivées par encapsulation ou l'incorporation de cellules remises en suspension dans l'ECM 12,15, plutôt que de sphéroïdes non adhérentes simples pré-formées. Protocoles suivants décrivent les procédures pour obtenir des mesures de Microrhéologie résolues en temps par l'acquisition et le traitement des données de microscopie vidéo, respectivement. Le traitement des données est décrit en utilisant MATLAB, faisant usage de routines open source pour PTM construit sur ​​des algorithmes initialement décrite par Crocker et Grier 42, qui ont également été largement développés pour différentes plates-formes logicielles (voir http://www.physics.emory.edu/ ~ semaines / idl /).

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Protocol

1. Sphéroïdes La culture de la tumeur

  1. Mélanger 10 ml de l'eau de qualité culture cellulaire avec 0,1 g d'agarose pour obtenir une solution d'agarose à 1%.
  2. solution d'agarose à la chaleur au-dessus de 70 ° C (plus ou moins 14 secondes dans un four micro-ondes standard ou à l'aide d'une plaque chauffante) avant aliquotage 40 ul de solution d'agarose dans un puits d'une plaque à 96 puits.
  3. Incuber la plaque à 37 ° C pendant au moins 1 heure tandis que la récolte de cellules en utilisant des techniques standard.
  4. Utiliser un hématimètre pour déterminer la concentration de cellules dans la suspension.
  5. Diluer la suspension cellulaire à 1.000 cellules / ml et ajouter 100 ul de cette dilution au puits contenant le lit d'agarose durci.
  6. Placer l'échantillon sur un agitateur pendant une nuit dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO 2.
  7. Enlever le modèle de secoueur et ajouter 100 ul de milieu de culture cellulaire.
  8. Incuber jusqu'à ce que des sphéroïdes de diamètre désiré soit atteint. Par exemple, après 9 jours, un spHeroid aura environ 450 m de diamètre. Pendant ce temps, un milieu de croissance frais peut être ajouté dans les puits d'aspiration mais doit être évitée car cela se traduira par la suppression de la sphéroïde.

2. Préparation Sphéroïdes tumorales 3D embarqués dans ECM

  1. Préparer une station de travail avec les matériaux nécessaires à l'intérieur d'une hotte à flux laminaire.
  2. Préparer un mélange dilué de 1 um de diamètre sondes fluorescentes traceurs carboxylate modifié par l'ajout de sondes 2 pièces en stock (2% de solides) pour 25 parties d'eau stérile.
  3. Retirer une bouteille de 3,1 mg / ml de collagène bovin du réfrigérateur et placez-le sur la glace.
  4. Aliquote de 125 ul de collagène dans un vide flacon de 2 ml.
  5. Ajouter 50 pi de solution diluée de la sonde de traceur dans le flacon contenant le collagène et vortex brièvement pour distribuer des sondes.
  6. Ajouter 235 ul de milieu de culture cellulaire approprié contenant du phénol rouge (qui devient jaune) pour un volume total de 410 ml et vortex brièvement avant de retirer 205 ml (demi le volume total) et le placer dans un nouveau flacon ml 2. Une fiole contiendra le sphéroïde de tumeur et Vial 2 sera un mélange de commande.
  7. Ajouter ~ 2 pi de NaOH 1 M au flacon 1 pour amener la solution revenir à pH neutre (milieu de culture contenant du phénol rouge devraient revenir à rouge). Notez que cela va provoquer le mélange de commencer guérir si elle n'est pas conservé dans la glace. brièvement Vortex à mélanger, puis retour au bac de glace immédiatement.
    NOTE: Le sphéroïde est à peine visible à l'œil nu après 9 jours de culture et son retrait de la chambre d'agarose est une tâche délicate. Utilisation d'un microscope de dissection peut être utile pour certains utilisateurs. Le maintien de l'intégrité du sphéroïde pendant le transfert est primordiale.
  8. En utilisant une pointe de pipette à large ouverture, retirez délicatement 40 pi de milieu du puits contenant de l'ellipsoïde de la tumeur. Conservez ce 40 pi tout en effectuant l'étape suivante.
  9. Vérifiez le bien afin de voir si le sphéroïdea été enlevé à l'étape précédente. S'il l'était, ajouter 40 ul contenant le sphéroïde au flacon 1. Sinon, placez les 40 pi dans le puits et répétez l'étape précédente.
  10. Incorporer délicatement 1 Vial (ne pas risquer de vortex, il peut endommager le sphéroïde) avant de transférer le mélange dans 60 parties de pi en trois puits séparés d'une plaque de 96 puits. Inspecter chaque puits avec un microscope après l'ajout de mélange pour déterminer qui contient bien le sphéroïde.
  11. Ajouter ~ 2 ul de NaOH 1 M et 40 ul de milieu de culture cellulaire dans le flacon 2 et vortex avant aliquotage 60 ul de ce mélange dans un puits vide dans la plaque à 96 puits et l'étiquetage comme témoin.
  12. Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pour durcir pendant au moins 1 heure.

3. Construire la grille de points d'échantillonnage et prenez une vidéo à chaque point dans

  1. Transférer la plaque de l'échantillon de l'incubateur de la platine du microscope. Laisser 10 minutes pour que l'échantillon EQUILibrate à la température ambiante si une platine chauffante n'est pas disponible.
  2. Observer l'échantillon avec de faibles lentilles de l'objectif motorisés pour s'assurer qu'il est intact et prêt pour l'imagerie. Déterminer la position de la tumeur à l'intérieur du puits.
  3. Décidez du nombre de points d'échantillonnage à prendre. En général, 20 points d'échantillonnage dans chaque puits, répartis en anneaux concentriques autour du sphéroïde produiront des résultats suffisamment détaillés.
  4. Déplacez le stade à chaque position souhaitée et utiliser un logiciel de microscope interface pour enregistrer les coordonnées x et y (ou enregistrer les coordonnées manuellement si l'interface du logiciel n'est pas disponible).
  5. Mettez le microscope à un objectif de haute puissance (typiquement 100X), et sélectionnez le cube de filtre approprié pour la longueur d'onde d'excitation des sondes de traceurs. Utilisez la liste des points créés à l'étape 3.4 pour passer au premier point de la grille.
  6. Ajustez la mise au point de trouver le fond du puits, puis déplacez-vous de trouver un champ de vision (FOV) contenant plusieurs trac de mise au pointer sondes.
  7. Observer l'histogramme de l'intensité et de régler l'intensité et la durée d'exposition pour donner la plus grande gamme dynamique possible, tout en veillant à ce que l'image ne soit pas saturé.
  8. Obtenir une séquence vidéo à un taux de 20-30 ms par trame de cadre (environ 800 cadres ou 16-24 sec de longueur est recommandé de fournir des statistiques suffisantes pour le calcul MSD robuste en équilibre avec la nécessité de réduire au minimum le temps d'acquisition à chaque point de la grille spatiale) et enregistrer avec une convention appropriée. Pendant l'enregistrement, ne touchez pas le microscope ou une table.
  9. Répéter les étapes 3.6 à 3.9 pour chaque point dans la grille de l'échantillon.
  10. Répétez les étapes 3.3 à 3.10 pour chaque bien dans l'expérience.

4. Analyser les données vidéo à Calculer Propriétés rhéologiques à chaque point dans l'échantillon

  1. Copiez toutes les données vidéo dans un dossier d'analyse (éventuellement sur un autre ordinateur).
  2. données d'image à l'importation dans MATLAB ou d'autres logiciels d'analyse.
    NOTE: documentation détaillée concernant l'ensemble des routines MATLAB particules de suivi adoptées ici est disponible à http://people.umass.edu/kilfoil . L'utilisation d'une fonction d'appel personnalisée pour le traitement de plusieurs fichiers à des positions différentes automatisation est recommandé.
  3. Calibrer le logiciel par l'analyse de plusieurs images de la vidéo afin de déterminer de manière appropriée sélection et de rejet paramètres (taille, passe-bande, etc) pour identifier les positions du centre de la sonde. Vaste expérience de ces étapes cruciales est décrit par Crocker et Grier.
  4. Utilisez le logiciel pour déterminer automatiquement à chaque position de la sonde pour toutes les images de la vidéo, puis relier ces positions dans les trajectoires.
  5. Utilisez les données de trajectoire pour calculer la moyenne carré déplacement (TMS) en fonction du temps de latence, en étant sûr d'appliquer le facteur de calibration spatiale appropriée (um par pixel) pour l'objectif spécifique, toute catégorisation de pixels, etc (généralement effectuédans les méta-données).
  6. Calculer G * (en utilisant la relation généralisée de Stokes-Einstein pris en considération les limites d'application de GSER pour un échantillon particulier 24,28,43. Alternativement, les utilisateurs peuvent souhaiter interpréter propriétés ECM directement à partir de MSD en comparant simplement la loi de puissance mise à l'échelle, plateau valeurs, indices d'hétérogénéité ou d'autres paramètres.
  7. Répétez les étapes 4.2 à 4.6 pour chaque fov dans l'expérience.
  8. Co-enregistrer les données de position de l'étape 3.4 avec modulii viscoélastiques à une fréquence d'intérêt particulier. Selon le fabricant du microscope utilisé, cette étape peut être facilitée par une routine personnalisée qui lit les métadonnées de microscope ou de la position des données peuvent être compilées manuellement.
  9. Utiliser des fonctions d'interpolation 3D pour générer une carte de la rhéologie spatiale de l'ECM.

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Representative Results

Pour vérifier la validité de G * (ω) des mesures à des positions localisées dans un micro-environnement de la tumeur modèle complexe, deux expériences de validation initiales ont été menées. Tout d'abord, nous avons cherché à valider nos mesures contre le «gold standard» de masse oscillante cisaillement rhéométrie. Nous avons préparé des échantillons identiques de matrice de collagène (sans cellules) à une concentration de 1,0 mg / ml de collagène. Ces échantillons ont été sondés avec un rhéomètre vrac (TA Instruments AR-G2, à l'aide de 40 mm de géométrie à plaques parallèles) et par PTM (en utilisant les mêmes paramètres que dans l'ensemble de ce protocole) et les mesures résultantes de G '(ω) et G "(ω ) ont été comparées (Figure 2A). Excellent accord a été trouvé entre les deux mesures. Deuxièmement, à établir la capacité de ce protocole pour mesurer des variations de points de ECM rhéologie nous avons préparé un 1,0 mg / ml matrice de collagène et perles de traceurs incorporés. L'échantillon a été ensuite traité avec uneinjection de 5 pi centralisée dispase (Figure 2B), qui digère rapidement collagène. Après une incubation de 3 heures pour permettre la digestion du collagène localisée à se produire, les données vidéo a été prise à des distances variables à partir du site d'injection, et la mesure de G '(ω) et G "(ω) ont été effectuées dans chaque cas. L'amplitude de G "(ω = 1 rad / s) a été trouvé pour être plus grande que celle de G '(ω = 1 rad / s) au niveau du site d'injection. Les mesures effectuées à des distances croissantes à partir du site d'injection ont été trouvés pour avoir une grandeur croissante de G *, ainsi que l'augmentation du ratio de G 'à G "(figure 2C). La taille de la région fortement dégradée de ~ 2 mm est conforme à une distance estimée de la diffusion d'une protéine avec hydrodynamique rayon R H = 1 nm (le poids moléculaire de 32,5 kDa est dispase) par l'intermédiaire de collagène digéré par la viscosité de η = 10 - 3 Pa · s à 37 ° C: . Par conséquent, les résultats sont en accord avec l'assouplissement prévu de la matrice à proximité du site d'injection, et démontrent notre capacité à effectuer des mesures précises localisées de matrice rhéologie.

Des données représentatives d'un modèle de tumeur 3D préparé selon ce protocole est représenté dans la figure 3. Données vidéo ont été recueillis à 19 endroits fixes dans l'échafaudage de collagène, formant une grille grossière autour de la tumeur (figure 3A). Ceci a été combiné des données de coordonnées avec les valeurs calculées de G '(ω) pour créer une carte spatiale des ECM raideur (figure 3B). Cette carte spatiale révèle clairement une zone de rigidité accrue immédiatement proximale par rapport à la sphéroïde de tumeur au jour 2, ce qui pourrait être corrélée avec le dépôt de collagène IV, la laminine un Vd autres composants de la membrane de sous-sol déposés par le sphéroïde se 17,18,44,45, ou compression locale de l'ECM par le sphéroïde expansion.

les événements d'invasion de la croissance tumorale et la matrice ont été surveillés pendant 4 jours. Deux régions ont été identifiées comme présentant soit aucune preuve de cellules invasives à la périphérie de la tumeur, ou une preuve d'envahir les cellules prononcé (figure 3C). Mesures ont été prises au PTM régions 1 et 2 sur 4 jours. Le jour 4, il y avait une différence significative dans G '(rapporté à 1 rad / s) entre les deux régions (figure 3D). Les mesures de fréquence dépendant de G 'et G "pour les régions 1 et 2 jours 4 montrent assouplissement significatif de l'ECM à la région 2, la région invasive (figure 3F). Le jour 4 région deux présente une réponse viscoélastique liquide comme, par mise à l'échelle évident visqueux de la parcelle G "(figure 3F).

Représentant sous-optimaleles résultats de l'analyse des erreurs expérimentales et communes sont représentées dans la figure 4. Peut-être la source la plus évidente d'erreur se situe dans la stabilité de l'installation sur laquelle la microscopie vidéo est effectué. Si la table de laboratoire est déplacée ou si il ya une autre source externe de vibration, les trajectoires de talon peut être influencé artificiellement, qui se traduit par une dérive dans les données. Drift provoque le MSD à augmenter considérablement au temps de latence élevé (figure 4A) qui provoque également la G '(ω) et G "(ω) valeurs calculées à augmenter fortement dans les basses fréquences (figure 4B). La dérive peut être réduite par l'utilisation d'un pneumatique, suspension pneumatique paillasse, et en prenant simplement soin de ne pas heurter l'installation tandis que les vidéos sont enregistrées. En outre, la dérive peut être enlevé durant le post-traitement utilisant des routines logicielles. Ces routines sont adaptées pour éliminer la dérive qui est approximativement uniforme sur un intervalle de temps connu. Dérive erratique (peut-être causéen se cognant la scène lors de l'acquisition de données) est plus problématique. Par conséquent, il est important de faire en sorte que l'échantillon reste mécaniquement isolé de l'environnement au cours de la collecte des données.

Une autre source potentielle des résultats imprécis vient de mauvaise interprétation de l'hétérogénéité des échantillons. Bien que la capacité d'observer et de quantifier l'hétérogénéité spatiale dans un échantillon est en effet l'un des points forts remarquables de PTM 26 (et quelque chose qui se perd dans les mesures traditionnelles en vrac de rhéologie), mauvaise regroupement de groupes de trajectoires de sondes peut conduire à des conclusions erronées. Étant donné que les changements dans ECM rigidité rapportés par cette méthode sont par nature hétérogène, comme c'est le matériau lui-même, dans un domaine donné de vue, il pourrait y avoir quelques sondes de traceurs qui ne sont pas élastique confinés par des fibres de collagène et donc libres d'explorer stochastique eau plus grande rempli pores (Figure 4C). Ces sondes "en vrac" exposition mobilité environ compatible avec un environnement purement visqueux. Comme les données pour toutes les sondes sont en moyenne avant modules viscoélastiques sont calculés, ayant quelques sondes en vrac dans une région d'échantillonnage donnée (champ de vue) peut produire des parcelles dépendant de la fréquence de G * (ω) qui varient énormément (figure 4D).

Calibrage du logiciel inadéquat peut entraîner des erreurs lors de la collecte et de l'analyse vidéo. Lors de la collecte de données vidéo, il est important d'observer l'histogramme de l'intensité et de régler le temps d'exposition pour donner la plus grande gamme dynamique possible, tout en veillant à ce que l'image ne soit pas saturé. L'analyse calcule les positions centrales raffiné pour chaque touche de palpage par l'intégration de la valeur d'intensité de chaque pixel. Si l'image est saturée, cette intégration sera moins précise en raison d'une section «flat top» du profil d'intensité. En outre, l'étalonnage fonction de recherche est une étape extrêmement critique pour assurer des résultats précis. Le bon choix des paramètres de sélection est primordiale. Ce processus a été largement décrite par Crocker et Grier 42, Savin et Doyle 43, et d'autres.

Figure 1
Figure 1. Schématique du protocole expérimental. (A) sphéroïdes de tumeur sont formées sur des lits d'agarose, puis transférés dans une matrice contenant des sondes 3D de traceurs incorporés. (B) des données vidéo est prise à plusieurs points dans le puits d'échantillon, à la fois à côté et loin de l'ellipsoïde de la tumeur. (C) Le mouvement stochastique des sondes dans chaque vidéo est analysé en vue de déterminer les propriétés rhéologiques de la matrice locale en chaque point de l'échantillon. Ces données sont compilées dans une cartographie des ECM rigidité tout au long du puits.ad/51302/51302fig1highres.jpg "target =" _blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Vérification des mesures. (A) Les éléments de G * (ω) sont présentés ici. Les valeurs calculées de G '(ω) et G "(ω) à l'aide PTM sont très similaires à ceux obtenus au moyen d'un rhéomètre vrac. (B) 5 pl de dispase ont été ajoutés au centre d'un puits avec un rayon r = 8,5 mm contenant 1,0 mg / ml de collagène pour mesurer les variations spatiales de la G * (ω). (C) des valeurs calculées de G '(ω) et G "(ω) au site de l'injection de la dispase, de 1,5 mm à partir du site, et de 3 mm à partir du site. En outre, une mesure de contrôle est effectuée dans une cupule contenant le même gel de collagène but sans traitement dispase. Près du site de traitement G '(ω) est plus petit que G "(ω). Comme le gel est échantillonné en outre à partir du site de traitement, les valeurs de G '(ω) devient plus grande que G "(ω), et de l'amplitude de G * (ω) augmente. Les mesures ont été prises 2,5 heures après l'injection dispase. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Quantification des changements dans ECM rhéologie concomitante avec le début de l'invasion de la matrice locale. (A) Le puits contenant un ellipsoïde 3D ​​PANC-1 est sondé à plusieurs endroits tout au long de l'ECM de collagène entourant la tumeur. (B) Coordonner données est combiné avec calculated G '(ω) pour chaque emplacement afin de produire une carte spatiale ECM de rigidité. (C) La croissance tumorale et le comportement d'invasion ont été surveillés pendant 4 jours. Deux régions ont été identifiées comme présentant soit aucune interaction avec les cellules envahissant (région 1, astérisque bleu) ou d'une interaction forte avec l'invasion des cellules qui spontanément ramifiés à partir de la grande masse primaire multicellulaire sphéroïde (région 2, astérisque rouge). Mesures (D) rhéologiques ont été prises au niveau des régions 1 et 2 sur 4 jours. Le quatrième jour, il y avait une différence significative de G '(rapporté à 1 rad / s) entre les deux régions. (E) Fréquence des mesures dépendantes de G '(ω) et G "(ω) pour les régions 1 et 2 jours 4 montrent assouplissement significatif de l'ECM à la région 2, précisément en corrélation avec la présence de populations invasives. G '(ω) et G "(ω) valeurs calculées en utilisant un ajustement de la loi de puissance à des données de TMS sont présentés comme rempli et vide points respectivement. Le jour 4, région deux expositions une réponse viscoélastique liquide comme comme on le voit par mise à l'échelle de la parcelle visqueux G "(ω) et l'absence de la ligne en forme de G '(ω). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. Données à partir des résultats sous-optimaux en raison de la dérive et de l'interprétation erronée de l'ECM hétérogénéité. (A) Le MSD d'une sonde de traceur confiné dans un matériau complexe suit loi de puissance mise à l'échelle <Ar 2 (τ)> ~ τ α (0 ≤ α ≤ 1). En conséquence, les valeurs de TMS devraient approcher un plateau à temps de latence longs. La dérive dans l'échantillon peut éliminer artificiellement ce problème, la lecture à l'escalade des valeurs de TMS au temps de latence longs. (B) Le laps de temps de dérive dans le temps MSD provoquera les valeurs de G '(ω) et G "(ω) pour devenir sensiblement erronée à des fréquences courtes. La dérive peut être éliminé ou réduit soit en assurant que l'échantillon est mécaniquement isolé lors de la collecte de données ou en utilisant des routines logicielles pour éliminer la dérive lors de l'analyse. (C) Même dans un petit champ de vue, deux variétés distinctes de trajectoires de sondes peuvent être présents. Dans cet exemple, la plupart des sondes sont confinés dans la matrice, mais quelques-uns sont «lâche» - leurs trajectoires sont beaucoup moins contraint. (D) Tenter d'interpréter les données de TMS à la fois limitées et sans contrainte sondes en même temps sans interprétation correcte de l'hétérogénéité de l'échantillon seront confondre mesures de modules viscoélastiques. S'il vous plaît climatck ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Dans ce protocole, nous introduisons une stratégie robuste et largement applicable pour le suivi longitudinal des changements locaux dans ECM rigidité dans des modèles de tumeurs 3D. Nous prévoyons que cette méthode pourrait être adoptée par les biologistes du cancer et biophysiciens intéressés par le comportement mécanosensible impliquée dans le remodelage matriciel pendant la croissance de la tumeur et les processus d'invasion. Quantification précise de la matrice cinétique de dégradation pourrait être particulièrement utile pour ceux qui étudient l'activité des métalloprotéases matricielles, lysyl oxydase ou d'autres espèces biochimiques pertinents dans des modèles de tumeurs en 3D qui sont directement liés à remodelage de la matrice. Au-delà de l'application de modèles de tumeurs 3D décrit ici, on pourrait encore imaginer la mise en œuvre de cette approche, en liaison avec d'autres systèmes modèles de maladie dans laquelle la modification de la matrice rhéologie dans le temps joue un rôle important 46,47. L'utilité de cette méthode continue d'être amélioré grâce à des améliorations de logiciel qui en outre automatee le processus et permettre des études augmentation de débit. Cela se traduira par des clichés de plus en plus détaillées sur le paysage physique de nombreux échantillons, en même temps, pour une utilisation dans des formats multi-puits.

Nous décrivons ici spécifiquement la mise en oeuvre de passive microrhéologie particule de suivi dans des modèles de tumeurs 3D, qui est bien adapté pour la mesure de la réponse visco-élastique linéaire dans la plage de ~ dizaines de Pascal typiques disponibles sur le marché des produits de la matrice extra-cellulaire (collagène bovin, extraits EHS-tumoraux ou échafaudages de nanofibres commerciales). L'observation de stochastique, le mouvement thermique moteur, même avec une optique de grande ouverture numérique de quantifier les petits déplacements de la sonde, est intrinsèquement limitée au régime linéaire de ces environnements ECM relativement souples, mais les enquêteurs désireux de sonder les matériaux plus rigides peut être en mesure d'adapter ce protocole pour une utilisation avec des manipulations actives via optique 48 ou 49 magnétique piégeage des sondes. Since les pinces optiques ou magnétiques sonder un seul point dans un échantillon et ne portent pas atteinte à l'intégrité de l'échantillon, ces techniques pourraient éventuellement être incorporés dans le protocole ci-dessus pour obtenir des mesures longitudinales d'échantillons plus rigides.

Il est important de noter que d'autres forces de cellules générées peuvent également contribuer à traceurs mouvements de la sonde à différentes échelles de temps. Par exemple, lors de la migration cellulaire survenant au cours des heures et des jours de culture, des grappes de sondes seront poussés et tirés en raison de mouvements cellulaires et il est en effet cette motion qui est utilisé dans la force de traction microscopie 50,51. Les mouvements de la sonde à sorption qui sont analysés pour obtenir des données de Microrhéologie lieu de l'ordre de quelques secondes, une échelle de temps nettement séparables. S'il est vrai également que la dynamique lente de stress et les contraintes associés à des forces de traction peuvent contribuer à des changements locaux dans la rhéologie 36, une force de cette imagerie-bapproche ASED réside dans la capacité à corréler les changements visuels et rhéologiques de l'échantillon. Par exemple, dans les résultats représentatifs de la Figure 3, un événement invasion de la matrice cellulaire et la migration évident est en corrélation avec un changement de G 'de près de quatre ordres de grandeur au cours du temps, cette migration a lieu.

Le protocole décrit ici suppose que les utilisateurs ont accès à un microscope avec une platine motorisée qui permet un positionnement reproductible de l'échantillon. Les laboratoires qui n'ont pas cette instrumentation pourraient encore faire des mesures ponctuelles en utilisant des marques ou d'autres repères visuels dans l'échantillon ou support pour permettre des mesures répétées au même point, mais il serait probablement difficile d'atteindre le même reproductibilité dans le positionnement comme indiqué dans le mesures longitudinales représentatives ici. Aux fins de ces résultats représentatifs ci-dessus, le positionnement sur l'axe Z a été maintenu à peu près constant. Toutefois, le cou de protocoleld également être modifiée afin d'inclure des mesures supplémentaires le long de l'axe z afin de créer une carte 3D rhéologique de l'échantillon. La méthode pourrait également être modifié pour utiliser un microscope confocal à balayage laser ou un multiphotoniques techniques de 3D sectionnement si des vitesses de balayage imposent une limitation sur les limites supérieures de fréquence accessibles qui peuvent ou peuvent ne pas être problématique pour une application donnée.

Dans ce procédé, une contrainte de temps importante est imposée par la nécessité d'un retour des cellules vivantes à l'incubateur. Sans une station météo boîtier temps de déchéance de contrôler la température, l'humidité et niveaux de CO 2, l'image du temps d'acquisition doit être minimisée. Même avec l'équipement approprié, la collecte des données prend beaucoup de temps et de la mémoire numérique, qui sont à la fois soumis à des limites pratiques. Par exemple, avec le microscope et de la caméra utilisée dans cette étude, il faudrait environ 35 heures pour prendre les quelque 4000 vidéos nécessaire de mapper un seul puits sur un 96Puits plaque à l'aide d'un objectif 100X sans espace entre les champs de vision. Ces facteurs imposent des contraintes sur le nombre de points de données qui peuvent raisonnablement être collectées. Le niveau de détail est donc soumis à des contraintes pratiques imposées par le temps disponible pour la collecte des données, l'espace de stockage de données et la disponibilité d'un logement de l'environnement.

La capacité de quantifier les changements dans ECM rhéologie pourrait être intégré aux côtés de méthodes fondées sur l'imagerie pour la quantification de la réponse thérapeutique dans des modèles de tumeurs 3D 17,18,52,53. Le modèle de système de culture multi-puits 3D adoptée dans les deux méthodes suggère une mise en oeuvre parallèle fournissant la corrélation entre la réponse cytotoxique et la modification de l'environnement mécanique. Cela pourrait faciliter le développement de nouvelles stratégies qui ciblent explicitement le phénotype mécanique ou élucident l'impact des traitements existants dans cette capacité. Cette idée pourrait être directement concernés par unepproches à améliorer l'administration de médicaments par le biais du stroma tumoral riche en collagène dense. Par exemple, dans le contexte de l'illustration représentative de ce protocole présenté ici avec des modèles de tumeurs pancréatiques in vitro, l'évaluation de la dégradation de la matrice suite à des interventions pourrait être utilisé dans le dépistage des schémas stromale de déplétion, un paradigme thérapeutique de plus en plus important pour le cancer du pancréas 54.

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Acknowledgments

Nous tenons à remercier le partage open-source d'un code de traces de particules MATLAB fournies par Maria Kilfoil ( http://people.umass.edu/kilfoil/ ), avec le code précédent IDL et une documentation détaillée fournie par John C. Crocker et Eric Semaines R.. Ce travail a été rendu possible grâce au financement de l'Institut national du cancer (NCI / NIH), K99CA155045 et R00CA155045 (PI: CPM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bovine type 1 collagen BD Biosciences, San Jose, CA 354231
PANC-1 American Type Cell Culture, Manassas, VA CRL1469 or other appropriate cell type
Fluorescent Microspheres Life Technologies, Carlsbad, CA 906906
Matrigel BD Biosciences, Bedford, MA 354230
Agarose Fisher Bioreagents, Waltham, MA C12H18O9
NaOH Fisher Bioreagents, Waltham, MA NC0480985
96-well Imaging plates Corning Inc., Corning, NY 3904
DMEM Hyclone, Waltham, MA SH30243.01 or appropriate cell culture media
Zeiss AxioObsever Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany includes high-speed camera and imaging software
MATLAB software The Mathworks, Natick, MA

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Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi
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Jones, D. P., Hanna, W., El-Hamidi, H., Celli, J. P. Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology. J. Vis. Exp. (88), e51302, doi:10.3791/51302 (2014).

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