原发性生肌前体细胞/成肌细胞从基底哺乳动物支系文化准备

Summary

在体外培养系统已被证明不可缺少的，以我们的脊椎动物肌肉发育的理解。然而，还有许多尚待了解非哺乳动物骨骼肌肉的发育和成长，尤其是在基础类群。一个高效，健壮的协议用于分离该组织中，肌细胞前体细胞（MPC）中的成体干细胞，并维持它们的自我更新，增殖，并在原代培养物分化的设置允许的保守和发散调节机制的识别整个脊椎动物的谱系。

Abstract

由于固有的困难，并参与研究体内生肌程序时，从骨骼肌的居民的成体干细胞来源的原代培养系统，生肌前体细胞（MPC）中，已证明不可或缺到我们的哺乳动物骨骼肌发育的理解和增长。特别是脊椎动物的基部类群，但是，数据是有限的，描述控制的自我更新，增殖和MPC的分化的分子机制。特别令人感兴趣的是背后基底脊椎动物经受相当大的后期幼骨骼肌肌纤维增生（ 即硬骨鱼）和全再生的附属物损失（ 即 urodele两栖动物）的能力的潜在机制。此外，使用培养的成肌细胞可能有助于再生和生肌程序的总结和它们之间的差异的理解。至为此，我们详细描述了一个强大和高效的协议（和其中的变化），用于隔离和维护的MPC和他们的后代，成肌细胞和未成熟的肌管，在细胞培养作为理解生肌计划的发展平台，与更多的开始基底脊椎动物。凭借斑马鱼（ 斑马鱼 ）的模式生物的状态，我们报告这个协议的鲤科鱼类分支亚科的小鱼应用。在串联，这个协议可以被用来从墨西哥蝾螈（Ambystomamexicanum），甚至啮齿类实验动物隔离多用途储值卡，以实现更广泛的比较方法。该协议是目前广泛使用的几种鱼类物种，包括虹鳟，鲑鱼和鲷鱼^1-4学习肌肉发育。

Introduction

哺乳动物肌肉发生的相当的了解已经通过这个过程的概括在这两个初级小鼠（ 小家鼠 ）的成肌细胞培养物和良好描述的小鼠衍生的细胞系中获得，C2C12 ^5。在20世纪50年代⁶起，这些文化都引发了很多进步的murinemyogenic程序的理解，并推而广之，肌肉发生在其他脊椎动物。此外，单细胞的肌纤维植技术已增加了相互作用的了解卫星细胞和周围的肌纤维^7-9之间。细胞培养物对肌肉发育的研究特别有吸引力因短时间从前驱分化的细胞^10，转染的相对容易的RNAi ^11-14，转基因^15,16和表达的研究^14,17,18， 在体外扩增后回输体内 ^18-20，甚至排版埃里森生肌前体细胞及其调节剂等不同分类群^21,22。而由于培养系统的人工环境的差异进行了说明^5,23，这些体外系统已被证明是不可缺少的，以我们的管的多核形成错综复杂的程序的夹层，终末分化的单核myofibersfrom称为myosatellite增殖祖细胞细胞（MSCs）的哺乳动物之一。

类哺乳动物之外，然而，控制肌肉发育机制，保护和/或发散了解甚少，主要是由于来自不同类群培养生肌前体细胞（MPC）中和成肌细胞的难度。事实上，主要的成肌细胞培养只被三鸟^24-26一爬行动物^27，少数两栖动物^28-30，和一些鱼类^1,3,4,31-33描述。从已经连续肌细胞系rtebrates比鼠类^34-36其它更是少见，唯一的非哺乳动物肌细胞系被来自日本鹌鹑（Cortunix粳稻 ）得出，QM7 ^37。尽管很多人试图在永生化，一个硬骨肌细胞系仍然是难以捉摸和协议，用于这些细胞的转染效率才公布，今年^15。因此，非常需要从多种脊椎动物的培养主要的MPC和成肌细胞清楚和优化的协议，不仅进一步扩大我们的生肌程序的演变知识，而是采用比较生理学的力量取得突破的人骨骼肌疾病和病症的治疗。

虽然文献中的MPC /成肌细胞分离^38-49很多报道，这是很常见的作家来描述简单，往往不完整，格式如隔离的协议。此外，最有启发性的协议回购RTED已经开发了用于小鼠^50-53，并且其中的一些依赖于抗体的选择^54,55或荧光的转基因^56,57，使得这些协议不可用或通过肌肉生物学家使用不切实际的最深处非啮齿类动物物种。随着对鱼，两栖动物，爬行动物肌肉发育，详细和全面的协议，与视听的指导，并与远缘物种证明效率描述鲜为人知的，将是最有帮助的领域。

首先由鲍威尔和他的同事在1989年⁵⁸所述，下列协议最初是从鲑鱼（即，虹鳟， 虹鳟和大西洋鲑， 大西洋鲑 ）和一些较大的鲤科鱼类（ 如金鱼，Carassiusauratusauratus）隔离的MPC和成肌细胞。 2000年，Fauconneau和Paboeuf优化的主要成肌细胞培养虹鳟鱼^{59，minoroptimizations}马去该协议利用的在亚科分支（斑马鱼， 斑马鱼 ，和巨人斑马，Devario ^{aequipinnatus）32，}由于可用于斑马鱼工作的许多遗传工具，因此，其近亲属的几个较小的小鱼。硬骨鱼是有吸引力的生物进行研究，由于其不同的发展战略（至少在大多数物种）。大鲑鱼，最喜欢的鱼类，生长不定，随着到期日由不受约束的渐近增长潜力，即使在年老^60-62。与斑马鱼，大danionins如巨人斑马⁶³和小胡子斑马显示增长潜力典型的硬骨鱼，使他们直接相拼理解一个理想的平台是否MPC细胞命运的选择对骨骼肌增生与肥大的作用。

同样地，我们已经证明，这个协议可与小鼠和蝾螈使用，具有相对高的细胞产量和VIABility指数。 Urodele蝾螈，如墨西哥蝾螈（Ambystomamexicanum），具备非凡的能力，再生组织，包括整个四肢和尾巴^64-66。这一特点使得这些两栖动物有趣的骨骼肌萎缩和老化模型。使用下面描述的协议，类似的方法可以进行，这已在许多鱼种已经完成，为这类研究更广泛的比较方面。因为许多真正比较生物学家理解的，在基本的生物学和生物医学平移最有意义的进步可以当数据被最广泛的光谱范围内进行分析（在此，整个脊椎动物谱系）制成。

Protocol

伦理声明：所有涉及本文所述脊椎动物实验是事先由阿拉巴马大学伯明翰分校的机构动物护理和使用委员会，并与实验动物福利，健康美国全国学院办公室既定准则卫生与人类服务部。 1，文化准备制备基础培养基如下：9毫米的NaHCO 3（每2升1.51克），20mM的HEPES（每2升9.53克）的DMEM（13.48克/ L，每2升26.96克）。 确定pH值调整到7.40，用HCl或NaOH。 <…

Representative Results

二十四小时后播种，生肌前体细胞（MPC）中应该是可见的附着于层粘连蛋白基质（参见图1a和 1d）。以下播种，细胞（MPC）中采用一个纺锤状的形状，表示该信元类型（ 图1），并MYOD1 +（ 图2）。在斑马品种，多用途储值卡显得更紧凑，更小的双极型工艺比执行从虹鳟和褐种多用途储值卡。然而，在四天的文化，所有鱼品种多用途储值卡检…

Discussion

生肌方案，在任何检查的物种，可以最方便地通过一个体外系统的研究。事实上，在隔离，生肌前体细胞（MPC）中的鱼或myosatellite细胞（MSCs）在哺乳动物中很容易进入这个涉及细胞增殖，细胞周期停药，并成肌细胞的终末分化和融合的成肌成肌管新生的高度管制的过程。普遍缺乏鱼品种的转基因报告基因的菌株（与斑马鱼⁶⁷和虹鳟鱼⁶⁹可能是个例外）限制在 MPC / MSC活…

Materials

			Table 1. Detailed Reagent Information
Reagent	Company (Preferred v. Alternate)	Catalog Number (Preferred v. Alternate)	Quantity per Culture
γ-irradiated poly-L-lysine	Sigma-Aldrich (MP Biomedicals)	P5899 (ICN19454405)	5 mg
DMEM (high glucose)	Sigma-Aldrich (cellgro)	MT-50-003-PB (D7777)	2 L
Laminin	BD Biosciences (Sigma-Aldrich)	CB-40232 (L2020)	1 mg
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP328-500 (S5761)	1.51 g
HEPES (C8H18N2O4S)	Fisher Scientific (Sigma-Aldrich)	BP310-1 (H6147)	9.53 g
Antibiotic/Antimycotic	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SV3007901 (A5955)	17-20 mL
Gentamicin Sulfate	Lonza (Sigma-Aldrich)	BW17-519Z (G1397)	2-3 mL
Donor Equine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007403 (H1270)	75 mL
Fetal Bovine Sera	Thermo Scientific (Sigma-Aldrich)	SH3007103 (F2442)	25 mL
Collagenase (Type IV)	Worthington (Sigma-Aldrich)	LS004189 (C9891)	0.44 g
Trypsin (from Pancreas)	MP Biomedicals (Sigma-Aldrich)	ICN15357125 (T5266)	1 g
			Table 2. Consumables, Tools and Equipment
Consumable	Tools	Equipment
Cell Culture Plates	Forceps (Coarse)	Serological Pipettor
Sterile 50 mL Conical Tubes	Forceps (Fine)	pH Meter
Laboratory Tape	Scalpel Handles	Chilling Incubator (Echotherm)
0.2 μm Vacuum Sterilization Systems	Scalpel Blades (#10, #11)	Laminar Flow Hood
Water-repellant Autoclave Paper	Surgical Scissors	Vacuum Manifold
Serological Pipettes	Glass Petri Dishes	Microosmolality Meter
	12-16 G Cannulas with Luer Locks
			Table 3. Optimized Volumes for Coating Cell Culture Plates
Plate Size	cm^2 per Well	Poly-L-lysine*	Laminin**
6 well	9.5	1.6 mL	1
24 well	1.9	0.32	0.2
48 well	0.95	0.16	0.1
96 well	0.32	0.06	0.03
*0.1 mg/mL concentration	** 0.020 mg/mL concentration
			Table 4. Media for Isolation, Dissociation, and Culture
Reagent	Isolation	Wash	Dissociation	Complete
Base Medium	419.25 mL	395.40 mL	297.00 mL	178.00 mL
PSF*	5.00 mL	4.00 mL	3.00 mL	2.00 mL
Gentamicin Sulfate**	0.75 mL	0.60 mL	–	–
Donor Equine Serum	75.00 mL	–	–	–
Fetal Bovine Serum***	–	–	–	20.00 mL
* PSF: penicillin/streptomycin/fungizone cocktail (100x); ** 50 mg/mL concentration; *** Characterized
			Table 5. Recommended Dilutions and Plating Volumes
Plate Size	cm^2 per Well	Dilution	Plating Volume
6 well	9.5	1.5-2.0×10^6 cells/mL	1 mL
24 well	1.9	1.5-2.0×10^6 cells/mL	250 μL
48 well	0.95	1.5-2.0×10^6 cells/mL	150 μL
96 well	0.32	1.5-2.0×10^6 cells/mL	50-100 μL
			Table 6. Average number of cells per g tissue
Species		Average # cells/g tissue
Danio rerio		6,400,000
Danio dangila		1,783,000
Devario aequipinnatus		1,797,000
Oncorhynchus mykiss		66,800
			Table 7. Recommended Incubation Temperatures
Species		Temperature
Danio/ Devario spp.		26 – 28 °C
Oncorhynchus/Salmo spp.		10* – 18 °C
Ambystoma mexicanum		18°C
* Lower temperatures support lower proliferation rates.